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重磅综述：m6A修饰在RNA病毒中的作用 | m6A专题
摘要
病毒转录组学是一个新兴领域，已有大量研究确定RNA修饰在调节RNA病毒生命周期中的中药作用。尽管在五十年前人们已经观察到了少数修饰的病毒RNA，甚至到最近几年才发现，人们对这些修饰如何调节病毒生命周期了解甚少。在本文中，我们回顾了m6A修饰在不同的病毒生命周期中的前病毒（所谓前病毒指病毒已经进入到细胞内部并形成一体，这样病毒才有机会创造更多的机会）和以及病毒侵染后抗病毒的相关作用，包括2'O-甲基修饰在RNA稳定性和先天免疫感应中的作用以及腺苷对逆转录病毒生活中肌苷修饰的功能周期。RNA上的100多种修饰的作用机制目前仍然未知，所以病毒上的RNA修饰是一个迅速兴起的新领域，注定会帮助科学家们提出新的对抗病毒的治疗方法。
1. 前言虽然表观遗传学领域确定了DNA和组蛋白修饰的重要作用，但表观转录组学的研究热潮才刚刚开始兴起，并与DNA甲基化及组蛋白修饰形成表观领域的三驾马车。就真核生物而言，RNA修饰在调节转移RNA（tRNA）和核糖体（rRNA）的结构和功能、mRNA翻译效率和稳定性、microRNA成熟体加工、细胞分化以及病原体的固有感应途径等方面发挥着重要作用。 真核生物中修饰最多的RNA是细胞rRNA和tRNA上存在的修饰RNA，它们调节RNA的结构和功能。在信使RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA）中已鉴定出几种修饰，例如N1-甲基腺苷（m1A）、N6-甲基腺苷（m6A）、5-甲基胞苷（m5C）、肌苷（I）、假尿苷（Ψ）、5'帽修饰N6,2-O-二甲基腺苷（m6Am）和2'-O-甲基化（2'-O-me）。最近已有全面的综述总结了检测此类修饰及其与RNA结合蛋白相互作用的方法。病毒转录组学领域的最新研究已经为病毒感染期间的这些化学修饰确立了同等重要的作用。例如取决于病毒的生活方式，m6A修饰可以正面影响RNA复制或负面地影响RNA装配。因此，m6A修饰可以具有前病毒或抗病毒功能，从而为抗病毒干预提供了新的潜在目标。转录组学的这些进步已经得到了几种研究RNA修饰和RNA结合蛋白的技术的支持。首先，高效液相色谱法与串联质谱联用技术（HPLC-MS / MS）的不断完善，使人们对检测RNA修饰及其丰度有了更大的信心。此外，转录组测序已与三种经典技术配对，以鉴定独特转录本中的特定修饰：（a）在修饰位点调查改变的碱基配对特性；（b）鉴定由修饰位点的反转录引起的截短的产物，以及（c）具有特定修饰的基于抗体的RNA分离和富集。结合使用这些技术有助于验证宿主和病毒RNA中存在的化学修饰。
据报道，HIV感染增强了病毒和宿主RNA的m6A修饰，而m6A的Writers和Erasers的敲低分别减少和增加了HIV感染。有趣的是，HIV感染期间在m6A处修饰了多个宿主mRNA如TRAF2、PABPC3和ETS2，它们都具有前病毒功能。鉴定和突变这些mRNA中的修饰的A碱基以检查它们是否在mRNA稳定性或mRNA翻译水平上发挥其前病毒功能将是一项有趣的工作。总之，HIV RNA中的m6A修饰能够调节病毒基因表达。这三个研究不同点在于，关于m6A修饰如何调控HIV基因表达的机制彼此并未达成共识。首先，HIV RNA基因组中m6A位点的数量和位置存在争议。肯尼迪等人仅在RNA基因组3'区域内鉴定出m6A位点；相反，Lichinchi等人在整个HIV RNA基因组中发现了14个m6A修饰，包括Rev响应元件（RRE）中的2个修饰，而Rev响应元件是由病毒Rev蛋白结合的结构化区域（HIV感染宿主促进病毒及T细胞m6A修饰）。这些修饰的碱基调节含RRE的RNA的核输出并增强病毒Rev蛋白与RRE的结合。奇怪的是，Kennedy等人已鉴定的11个修饰位点都位于位点的5’端处。为什么这三项研究绘制病毒m6A测序图谱会产生如此不同的结果？一些明显的原因可能是病毒株、细胞系以及生化试剂都未能统一。例如，m6A免疫沉淀的RNA测序结果和紫外交联免疫沉淀实验中的RNA测序结果可能都会影响分析的准确性。此外，生物信息学上的算法及分析方法不同也会造成一些误差。此外，不同的病毒复制动力学也可能影响Writers、Erasers和Readers的动态行为。Lichinchi等人使用的是m6A抗体免疫共沉淀的方法来富集m6A修饰RNA。相反，肯尼迪等人用4-硫尿苷标记病毒RNA，然后将m6A抗体与全长RNA交联。另外，标记的YTHDF1-3阅读蛋白与病毒RNA的基于细胞的交联在两种方法中均显示出非常相似的交联位点。因为片段化的mRNA和全长RNA相比，m6A抗体对这些m6A位点的IP性能可能不同，所以如果高阶RNA结构在抗体辅助识别m6A碱基中起作用，则这些不同的方法可能会产生不同的结果。因此，在进行m6A-seq的分析之前，YTHDF蛋白与目标RNA的交联应将有助于把潜在的假阳性减至最少。此外，每种YTHDF对HIV转录和复制的作用仍存在争议。肯尼迪等观察到，YTHDF阅读蛋白的过表达增强了HIV复制和HIV p24、p55和Nef蛋白的丰度，而Tirumuru等人观察到YTHDF蛋白的过表达会抑制逆转录和HIV复制。两项研究都使用过表达和敲低，使用了类似的VSV假模型和HIV感染模型。目前尚不清楚是什么导致了两项研究之间的巨大差异。YTHDF阅读蛋白的非生理过度表达或非定量敲低可能会揭示与正常生理状态下无关的结果发生。由于m6A修饰是可逆的，因此在动态过程中，Writers、Erasers和Readers可能靶向不同的m6A碱基，而该过程可能受到细胞的生长状态或受HIV感染的细胞事件的影响。最近的研究表明，Tirumuru等人使用的HIV基因组中存在萤火虫荧光素酶报告基因序列。可能会影响YTHDF的表达丰度及其对HIV复制的影响，因为该非病毒RNA序列可被m6A过度修饰。除了YTHDF蛋白在调节HIV生命周期中的作用外，hnRNP蛋白还可能以m6A依赖性方式与HIV RNA相互作用。hnRNPC已显示与m6A修饰的RNA相互作用，促进预剪接事件。先前的研究表明，其他hnRNP蛋白也会影响HIV的生命周期，包括许多与HIV Rev蛋白相互作用的hnRNP蛋白。因此，Rev与HIV RNA中存在的含m6A的RRE元件的结合可以通过hnRNPC来调节。 2.3 m6A在丙型肝炎病毒（HCV）和寨卡病毒（Zika virus）生命周期中的作用直到最近，几乎没有证据表明功能性m6A甲基转移酶在核外起作用。最近对仅具有细胞质生命周期的病毒的研究表明，Writers在细胞质中也具有更广泛的作用。最近的两项研究描述了m6A修饰在调节黄病毒科不同成员中的作用，黄病毒科的基因表达发生在细胞质中。迄今为止，已经在感染了HCV、登革热病毒（DV）、西尼罗河病毒（WNV）、黄热病病毒（YFV）和三株寨卡病毒（ZV）的细胞中进行了m6A分析。HCV RNA通过miRNA和RNA结构的调控已广为人知。肝脏特异性miR-122是HCV复制所必需的，并且已显示在HCV基因组5'端的两个位点结合，以保护病毒RNA免受宿主细胞外切核糖核酸酶的降解。此外，使用通过引物延伸（SHAPE）分析的选择性2'-羟基酰化作用，许多结构和核糖核苷酸相互作用已显示出在调节病毒生命周期中的重要作用，因为突变这些位点会导致抑制或增强病毒复制。斯塔西·霍纳（Stacy Horner）的实验室最近提供了另一种RNA调控水平。Gokhale及其同事在HCV RNA基因组中鉴定出19个m6A富集位点，包括跨越5'UTR，核心基因以及HCV基因组内其他基因的位点。已显示5'UTR中存在的m6A以不依赖帽的方式增强mRNA的翻译。该观察结果可以解释病毒（例如HCV）如何利用不依赖帽的机制来引发病毒蛋白的产生。HCV包含一个内部核糖体进入位点（IRES），该位点直接结合核糖体的40S亚基，但是没有利用到帽结合蛋白复合物eIF4F。虽然Gokhale等没有在没有m6A Writer的情况下检测到HCV翻译缺陷，当eIF4F丰度较低时可以翻译的其他病毒基因组，可能会受到m6A修饰的影响。
siRNA介导的甲基转移酶METTL3、METTL14和FTO的敲低证明了m6A修饰在HCV病毒生命周期中的重要性，这表明METTL3 14负调控HCV蛋白表达，而FTO增强了病毒蛋白表达。另外，阅读蛋白YTHDF家族与调节病毒组装有关。YTHDF1-3阅读蛋白与HCV RNA共定位在脂质滴上，脂质滴是HCV病毒体组装的位点，并在不影响病毒复制的情况下负面调节病毒的组装。YTDFH蛋白特别是与一个存在于HCV RNA包膜蛋白编码基因中的m6A位点相互作用。该位点包含DRAmCH的基序（motif），该基序是腺苷甲基化的特征性靶标。该位点的突变分析与HCV病毒滴度提高了3倍相关，而不会影响病毒复制或蛋白质生产。含有m6A基序的RNA区域已被HCV核心蛋白结合，从而促进了病毒体的包装和组装。该位点的突变减少了YTHDF蛋白的结合，并增强了HCV Core蛋白的结合。YTHDF的作用可能是抗病毒的，其中增强的结合会导致新生病毒粒子的生成减少，而核心结合会阻止YTHDF结合，从而增强脂质小滴内的病毒粒子组装。确定哪些信号通路激活病毒RNA基因组内不同位点的METTL3/14介导的甲基化修饰将非常重要，以识别可能成为抗病毒干预目标的潜在抗病毒途径。
黄病毒科的另一个成员寨卡病毒最近受到了科学界的关注。在寨卡病毒感染期间，腺苷A，胞嘧啶C和尿嘧啶U核糖核苷酸上的2'-O-甲基修饰非常丰富，而寨卡vRNA基因组内存在惊人的3％的m6A修饰比例。此外，来自非洲的MR766病毒株中存在12个m6A独特的富集位点，其中一半存在于编码病毒RNA的非结构蛋白NS5和3'UTR区的区域中。类似于m6A在调节HCV生命周期中的作用，METTL3和METTL14抑制复制，而ALKBH5和FTO增强寨卡病毒的复制。此外，甲基阅读蛋白YTHDF1-3结合寨卡病毒中的m6A修饰RNA，这与病毒RNA衰变和病毒复制减少有关。这些数据得到了实验的证实，缺少METTL/14会阻止YTHDF阅读器蛋白对寨卡病毒复制产生负调控。因此，寨卡病毒内的m6A修饰与HCV类似，尽管通过不同的机制也对病毒的生命周期产生负面影响。迄今为止，已有几项研究确定了响应寨卡病毒感染的宿主基因表达谱。寨卡病毒调节受感染宿主细胞中的干扰素反应、细胞周期、蛋白质定位、ER应激和凋亡等途径。抗病毒反应需要进行微调，以最佳控制病毒感染而不会引起免疫介导的病理。 如上所述，宿主细胞RNA中的RNA修饰可在病毒感染期间发挥重要作用。确实，寨卡病毒感染导致宿主mRNA的m6A修饰富集。由于m6A在转录后水平上起作用以改变下游途径，因此，尽管富含m6A修饰，但编码IRF8、INFAR1、IFNAR2、MAP3K3和IFIH1的抗病毒蛋白的mRNA的丰度没有明显变化也就不足为奇了。响应寨卡病毒感染后，其中一些基因很可能在转录后水平受到调控。例如，应激诱导的宿主转录本的5'UTR中的m6A修饰水平的增强，在这些mRNA的不依赖帽的翻译中起作用。实际上，已知黄病毒科病毒家族的成员可调节应激反应途径和未折叠的蛋白质反应。最后，YTHDF2通过与热休克处理过的细胞核中的这些位点结合，调节FTO去除热休克诱导的mRNA的5'UTR中m6A修饰的能力。因此，YTHDF与宿主和病毒RNA中的m6A位点结合可能阻止宿主甲基转移酶调节m6A富集。结果，宿主mRNA中可能发生mRNA稳定性和翻译效率的变化。对于寨卡病毒RNA，这种作用似乎导致控制寨卡病毒的复制。除了抑制m6A修饰黄病毒科两个成员生命周期的重要性外，还观察到其他家族成员在其RNA基因组中包含m6A修饰位点。最近报道了WNV、DV和YFV中存在m6A修饰，并且发现了NS3、NS5和3'UTR中m6A修饰的唯一保守位点。值得注意的是，这些蚊虫传播的病毒均包含调节病毒翻译和复制的二级RNA结构，其中许多位于5'UTR和3'UTR内。最近的一项研究确定了3'UTR茎环结构对于蚊子向人类传播的病毒复制和适应性很重要。也许人类和蚊子细胞中m6A的富集受到不同的调节，从而导致局部RNA结构的改变和RNA结合蛋白的募集。例如位于3' UTR中富含多嘧啶的基序附近的推定位点处的甲基化可以调节RNA折叠和hnRNP C的结合，这对于HCV基因扩增是必不可少的。进一步的研究对于鉴定这些病毒在不同宿主中的甲基化组之间的差异以鉴定在病毒发病机理中的作用将是重要的。3. m6Am修饰在病毒生命周期中的作用除了m6A之外，m6Am修饰在帽结构m7GpppN中也很丰富，存在于大多数病毒和所有宿主mRNA的5'端。最近发现这种化学修饰在调节mRNA稳定性中起作用。Mauer等在含有腺苷作为其第一个核苷酸的真核mRNA中发现了这种新颖的帽附近修饰。这种修饰是FTO的优先底物，与先前鉴定的底物m6A相比，对m6Am的催化效率高100倍。发现FTO和m6Am之间的优先相互作用是由于腺苷与RNA m7Gppp帽的邻近，用未发生甲基化的鸟嘌呤G替代m7G会降低相互作用速率。此外已证明可去除mRNA上m7Gppp帽的酶DCP2是负责读取m6Am修饰的酶。尽管尚无正式研究证明METTL3/14对m6Am的作用，但该甲基Writer复合体可能负责添加此帽特异性部分。Schwartz等人的发现证实了这一假设，该过程独立于WTAP。有趣的是，RNA中m6Am与m6A存在截然不同的功能。m6A似乎在增强mRNA降解中起着作用，而m6Am的存在可以稳定RNA。在流感病毒和单纯疱疹病毒1型中已观察到m6Am的修饰。然而，这种修饰在调节病毒生命周期中的作用尚待探索。可能是m6Am稳定病毒RNA的方式类似于宿主mRNA所观察到的，这表明病毒可能利用这种修饰来控制细胞内病毒RNA的丰度。4. 核糖部分的2'-O-甲基化（2'-O-me）在病毒生命周期中的作用2'-O-me修饰是在所有类型的真核RNA上发现的高度丰富的化学修饰。已显示2'-O-me合成的RNA可以作为先天性免疫受体TRL7的激动剂，在小鼠和人类细胞中抑制包括I型干扰素在内的炎性细胞因子的产生。因此，许多用于基因操作的siRNA在2'核糖上含有修饰的碱基，以防止异常的免疫反应。达菲斯等鉴定出黄病毒、痘病毒和冠状病毒的成员利用病毒编码的甲基转移酶添加2'-O-甲基病毒帽结构，从而逃避了小鼠中IFIT1发挥的抗病毒活性。IFIT1是IFIT家族的成员，该家族通过与病毒蛋白和RNA结合并调节其功能来限制病毒复制。在人细胞中，IFIT5（而非IFIT1、IFIT2或IFIT3）抑制了WNV突变体的感染，该突变体缺乏生成2'-O-me基团的能力而不影响NS5的N7甲基转移酶活性。这些发现表明，包含2'-O-me RNA修饰的细胞质病毒通过逃避由不同干扰素诱导的IFIT蛋白引起的抗病毒作用，具有增强的毒力。有趣的是，许多IFIT家族成员减弱了翻译，这表明利用2'-O-me可以调节病毒的致病性。除免疫逃避外，病毒RNA上的2'-O-me可防止在冠状病毒家族成员感染细胞期间由dsRNA传感器MDA-5介导的I型干扰素产生。与野生型病毒相比，在非结构蛋白Nsp16中缺乏2'-O-me酶促活性的突变型人冠状病毒增强了原代人巨噬细胞中IFN-β的表达，表明2'-O-me在控制中具有生物学上的重要作用干扰素反应。该过程依赖于MDA-5，因为在感染了缺乏酶促2'-O-me功能的鼠冠状病毒小鼠肝炎病毒（MHV）后，mda5基因敲除的鼠巨噬细胞未能产生可检测水平的IFN-β。体内感染模型表明，在没有2'-O-me活性的情况下，干扰素信号传导是控制MHV感染的关键组成部分，因为干扰素α/β受体（Ifnar）敲除小鼠拯救了突变病毒的传播和复制，类似于野生型MHV病毒感染。此外，突变型和野生型病毒在Mda5/Tlr7双敲除小鼠中的生长反映了在Ifnar敲除小鼠中观察到的水平，证实了这些传感器对于检测MHV至关重要，并且2'-O-me是这种细胞质病毒的致病因子。与针对缺乏2'-O-me功能的WNV的IFIT介导的限制机制相反，Ifit1敲除巨噬细胞将MHV复制完全恢复为野生型病毒水平，表明这种MDA-5依赖性IFN-β产生是一种独特的机制，因为IFIT1和IFIT2过表达无法挽救突变型WNV复制。5. 腺苷对肌苷修饰（(A-to I-editing）在逆转录病毒生命周期中的作用腺苷到肌苷修饰的重要性（A到I编辑，A-to I-editing）在宿主RNA和病毒RNA中都非常丰富。从A到I的编辑是由RNA腺苷脱氨酶（ADAR）介导的，它催化双链RNA（dsRNA）中碳6的脱氨作用以产生肌苷修饰。从A到I的编辑会导致肌苷-尿嘧啶错配导致dsRNA结构不稳定，这比原始的腺苷/尿嘧啶配对不稳定。存在三种ADAR，即ADAR1-3，它们都对不同的细胞信号敏感，并且它们的表达是细胞特异性的。迄今为止，已观察到肌苷的存在可调节多种病毒的宿主-病毒相互作用，包括呼吸道合胞病毒和HIV。ADAR基因的突变已通过内源宿主RNA的胞质传感器激活I型干扰素信号传导途径而与异常的先天免疫反应相关。使用基因敲除动物模型，发现ADAR1的缺失或突变可显着增强干扰素诱导的基因在胎儿肝脏中的表达，从而导致凋亡和炎症加剧。有趣的是，在少数特定基因的3'UTR中发现了A对I的超编辑。根据计算机模拟的结构分析，用肌苷取代腺苷会抑制完美的dsRNA茎环结构，从而阻止长匹配dsRNA的形成。这些发现表明，缺乏A-to-I编辑的内源RNA可以被胞质传感器识别，从而激活对双链RNA的先天免疫应答。以前已经在HIV感染的人类细胞系中研究了A对I编辑的作用。使用siRNA敲除和过表达方法，发现ADAR1分别与p24 Gag蛋白的表达降低和增强相关。重要的是，可以通过ADAR1表达载体挽救siRNA敲低介导的Gag蛋白表达降低，这表明ADAR1在调节人类细胞中HIV的生命周期中发挥了积极作用。这些观察的重要性通过原代人CD4+ T细胞中ADAR1的表达模式得到了强调。仅在刺激的T细胞中，ADAR1表达增加，而ADAR2表达保持不变。此外，在静止的CD4+ T细胞中HIV的产生极少，这表明活化的CD4+ T细胞中ADAR1表达与HIV病毒基因表达之间存在联系。已经提出了不同于ADAR1的RNA编辑活性的其他机制，可促进HIV和水泡性口腔炎病毒（VSV）的生命周期。突变ADAR1的酶促区域确实增强了HIV复制。该观察结果与用酶沉默的ADAR1突变体转染的细胞中磷酸化PKR和eIF2α的减少有关，表明与VSV感染相似，类似的PKR靶向机制可能有助于增强HIV复制。但是，RNA编辑依赖和独立的机制可能并不相互排斥。最后，与野生型HIV相比，含有A至G突变的合成HIV构建体似乎更有效地表达。但是，没有迹象表明这种HIV分离株是否自然存在。这些A-to-I研究提供了RNA修饰在调节病毒生命周期和感染过程中免疫应答中的重要性的更多实例。6. 总结在这篇综述中，我们着重指出了最近在鉴定独特的腺苷修饰在调节病毒生命周期和对病毒感染的免疫反应中的作用方面的最新进展。我们没有涉及某些修饰，例如m5C和假尿苷Ψ，因为关于它们在调节病毒RNA或细胞抗病毒应答中的作用的信息不足。奇怪的是，某些修饰如m6A在不同的病毒生命周期中同时具有前病毒或抗病毒功能。这种相反的作用可以归因于病毒RNA的胞内定位，以及因此对m6A修饰RNA响应的宿主蛋白的可用性。显然，病毒表观转录组学领域正在迅速发现这些RNA修饰的重要性。了解病毒和细胞RNA中这些修饰的动力学如何影响病毒生命周期和病毒发病机理的不同步骤，将为新型抗病毒疗法的发展提供帮助。
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