干货：m6A进入深水区后下半场研究该怎么玩 | m6A专题

2020年，单细胞测序继续在各大学术杂志上霸屏刷榜，然而另一个当红炸子鸡m6A研究慢慢进入到了精细化耕作阶段。

与三年前的惊艳相比，2020年m6A研究与疫情一样，慢慢陷入了一个低谷，进入了无人区与深水区。但是通过这一轮筛选，一定会出现更多优秀的m6A研究

 从各大顶级期刊已发表的m6A论文来看，风向标从Resource开始向Article转变，占坑类文章的潮水开始褪去，向着更加明确的应用场景延伸，涉及到的课题方向已经脱离了传统甲基化酶→靶基因→与表型关联的三板斧套路。

下面我们就来先看看2020年上半年有哪些值得关注的亮眼研究，随后笔者将会接下来就m6A几个未来的发展方向提出一些粗浅的看法，也请大家一起参与讨论交流。

2020年上半年亮点研究汇总
1 神仙打架，群众吃瓜

对于康奈尔医学院的Jaffrey大家并不陌生，他除了是m6A测序发明人之外，更多的焦点是跟何川教授课题组的相爱相杀，在顶级期刊上各种掐架。

2020年6月，Jaffrey在Cell上发表A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating m6A-Modified mRNA称，YTHDF1和YTHDF3并不能促进翻译，DF1/2/3这三种蛋白都是促进带有m6A修饰的RNA产生降解。

这篇文章从投稿上颇为曲折，去年7月就已投稿，历经数次返修终于在5月被接受。即便如此，何川课题组并没有停下脚步。

作为发现YTHDF家族蛋白诸多功能的先驱，何川教授在阐明FTO去甲基化酶的功能后，继续开足马力挖掘了大量与m6A修饰相关酶的生物学功能。

同样在2020年6月底，何川教授联合芝加哥大学的人类遗传系贺信教授、统计遗传学家Matthew Stephens教授一起在遗传学顶级期刊Nature Genetics发表长文称，YTHDF能够促进翻译。 

这次甩出的王炸证据可谓是多维度“打脸”Jaffrey，两人的战争已经从究竟FTO调控m6A还是m6Am，燃烧到了YTHDF的生物学功能上。

何川课题组的张子杰博士（本次NG的第一作者）很巧妙了选用了淋巴母细胞作为研究材料。这是非常理想的遗传学研究工具。

本文创造性地提出了m6A-QTL概念，并做了大量统计学和遗传学分析，如45组遗传病的GWAS分析、splicing QTL（sQTL）、TWAS分析等，配合翻译组、RNA结合蛋白的eCLIP测序等数据对METTL3和YTHDF敲低细胞进行进一步研究后，与已发表的大量文献中的生化数据和测序数据一起做分析，否定了Jaffrey关于YTHDF家族不调控翻译的结论。

这篇文章中，sQTL、TWAS等并不是新方法，第一次与m6A-QTL相结合，也算是亮点之一。

点评：

Jaffrey和何川教授的文章，为我们提供了新思路，与遗传学、统计学、结构生物学等细分领域进行合作，会越来越成为趋势。但是背景和前提包括扎实的统计学基础，足够的经费投入以及课题组前期已打好的生化分子生信等基础，任何环节的缺失都会带来不小的阻力。

2药物开发的新方向

2018年，斯坦福大学的著名遗传学家张元豪（Howard Chang）与芝加哥大学何川教授共同创立Accent Therapeutic，以建立靶向RNA修饰蛋白（RMPs）等表观修饰领域的治疗方案为主，进行相应药物开发。同年在Nature Reviews Drug Discovery发表名为RNA-Modifying Protein as Anti-Cancer Drug Targets的综述。

2019年，何川的弟子杨财广教授与陈建军教授及钱志坚教授合作在Cancer Cell发表文章，公布了两种针对FTO的小分子抑制剂——FB23和FB23-2。

2020年6月，陈建军教授继续在Cancer Cell发力。课题组基于FTO晶体结构从美国国家癌症研究所数据库中的26万个小分子化合物中，通过计算机模拟方式筛选出了两个潜在的抑制剂——CS1 (Bisantrene)和CS2 （Brequinara）。

后期通过一系列生化实验从细胞和动物水平，这两种化合物对急性髓细胞白血病有显著的抑制作用。另外，除了对AML外有作用外，陈建军教授还发现这两种化合物对其他的实体瘤如乳腺癌、胰腺癌等具有显著的杀伤作用。

点评：

部分在肿瘤及相关免疫性疾病中表达异常的甲基化酶，设计相应小分子靶向药物是后m6A研究的重要分支方向。这方面需要计算生物学、生物化学、基础医学、化学与高分子纳米材料等方向的研究人员进行跨学科合作。

3 靶向RNA进行m6A修饰和去m6A修饰

2020年5月，联川生物客户来自中山大学药学院王红胜课题组在Nucleic Acids Research期刊上发表题为Targeted mRNA demethylation using an engineered dCas13b-ALKBH5 fusion protein （联川生物提供m6A测序服务）的研究论文，成功构建基于dCas13b-ALKBH5的融合蛋白体系dm6ACRISPR，实现在活细胞内靶向mRNA进行去甲基化修饰。同时，在肿瘤细胞中运用dm6ACRISPR靶向促癌基因EGFR和MYC，可显著降低其表达和抑制肿瘤细胞的生长。

2020年6月，基因编辑大牛来自哈佛大学及Broad Institute的David Liu（刘如谦）在顶级生物技术期刊Nature Biotechnology发表Programmable m6A modification of cellular RNAs with a Cas13-directed methyltransferase的文章。

文章以RNA靶向的内切酶系统CRISPR-Cas13为基础，构建出新的m6A RNA精准编辑工具--TRM编辑器，该工具只需融合蛋白和向导RNA两种组分，可实现细胞核和胞浆内m6A的高效精准编辑。之后研究者还利用该工具证实了m6A甲基化改变对RNA转录本丰度及可变剪接的重要调控作用。

David Liu成功构建出以Cas13为基础的RNA m6A精准编辑的新工具-TRE的编辑器，与之前的m6A编辑工具相比，TRM编辑器更加简单，且可实现细胞核和胞浆内RNA m6A的高效精准编辑。

新的m6A编辑工具的开发为m6A功能研究提供了更加有力的武器，这或将进一步推动m6A RNA甲基化研究的发展。

点评：

精确靶向RNA后进行m6A修饰和去m6A修饰操作，具有比影响m6A催化酶继而调控下游靶RNA有着更好更准确的效果。与cas9相比cas13靶向目标为RNA，与FTO、METTL3等催化酶融合后可以发挥多重功效。融合蛋白等通过改造的技术未来极具潜力。

4R-Loop与m6A

2020年1月，Nature Genetics上一篇名为N6-methyladenosine regulates the stability of RNA:DNA hybrids in human cells.的文章称，m6A修饰可以调控R-loop环。

R-loop是由RNA-DNA单链互补杂交后和未配对的单链DNA形成的核酸结构，代表哺乳动物细胞中基因组不稳定的来源。诺丁汉大学研究人员表明，在人类多能干细胞中的大多数RNA-DNA互补结构上都可以检测到m6A修饰，导致并影响了mRNA在代谢上的不同方面。包含m6A修饰的R-loop在细胞有丝分裂准备期即G2/M期积累，并在细胞周期的G0/G1阶段被耗尽，并且促进由YTHDF2介导的mRNA降解。YTHDF2作为RNA甲基化阅读蛋白，在细胞分裂时显著富集在R-loop上。因此，YTHDF2敲除导致哺乳动物细胞中R-loop水平升高，细胞生长迟缓和γH2AX（DNA双链断裂的标志物）出现富集。论文中结果表明，m6A调节R-loop的积累，这暗示了m6A修饰在维护基因组稳定性中的重要作用。

2020年7月，中山大学赵勇课题组在Molecular Cell在线发表题为METTL3 and N6-methyladenosine Promote Homologous Recombination-Mediated Repair of DSBs by Modulating DNA-RNA Hybrids Accumulation 的文章。

该工作发现METTL3、m6A-RNA以及YTHDC1是DNA双链断裂修复的参与者，由METTL3/m6A-RNA/YTHDC1/DNA-RNA Hybrids（R-Loop）组成的分子轴对于促进同源重组修复DNA双链断裂具有重要作用，为后续的基础及临床研究提供了新思路。

点评：

R-Loop测序技术特指能够研究DNA和RNA复合物的一种高通量测序技术，跟m6A相关联也是去年年底到今年年初一个新的学术热点。有相关需求的研究人员，除了思路正确外，还需要那么一点点运气，当然烧钱也是必不可少的。

5 三代纳米孔测序

来自英国邓迪大学的研究人员，在eLIFE上发表Nanopore direct RNA sequencing maps the complexity of Arabidopsis mRNA processing and m6A modification称，三代纳米孔测序可直接对RNA直接进行测序，以检查野生型拟南芥中mRNA上甲基化修饰（m6A）突变体的RNA。

三代测序结果显示m6A可以在全长mRNA转录组中定位，并揭示了与5’Cap帽相关的转录起始位点，剪接事件，polyA位点选择和polyA尾长的组合多样性。来自3'UTR的m6A的缺失与转录本丰度的相对降低和RNA 3'末端形成的缺失有关。破坏的m6A的功能性后果是昼夜节律周期的延长。

作者得出结论，纳米孔测序可以揭示全长单分子读取中mRNA加工和修饰的复杂性。这些发现可以完善拟南芥基因组注释。此外，将这种方法应用于研究较少的物种可能会改变我们对其基因组编码的理解。

点评：

新技术有许多风险，新方向也有风险大概率花了钱之后会打水漂。这类文章通常竞争激烈，看似门槛不高，但是会拖住许多课题组的精力。追新赶时髦有风险，请谨慎对待。除非前期许多预实验与设想吻合。三代纳米孔测序一些劣势联川生物曾经有过专题报道（成为舞台焦点的RNA表观修饰）。另外2020年北京大学伊成器教授也在Protein & Cell杂志发文称，三代测序做RNA甲基化仍然存在假阳性过高的问题。

6

泛基因组+进化让m6A威力加倍

来自南京农大以及德州大学奥斯汀分校的研究人员，通过分析五种不同多倍体棉花进行泛基因组进化分析后发现，尽管这些多倍体棉花基因组在基因含量和同义性上保守，但已通过亚基因组转座子交换呈现多样化，继而平衡了基因组的大小、进化速率的异质性、同源物之间的正向选择等。其中选择和进化驱动了两种不同栽培棉纤维中相似同源基因平行表达，这包括了诸多与m6A修饰调控相关的基因。

点评：

GWAS、泛基因组等方向与m6A关联，是巧合也是一个发展方向。在育种和人类遗传病等领域相关研究中，大样本做关联分析已经不是主流，而后群体做关联分析必须要锚定一个新方向才能获得关注。这类研究不仅烧钱，还容易进入死胡同，一般课题组请不要轻易尝试。

7新型的m6A测序方法

2020年4月，浙江大学刘建钊课题组在Nature Chemical Biology上长文发表题为A metabolic labeling method detects m6A transcriptome-wide at single base resolution的研究，报道了一种称为m6A-label-seq的高通量测序方法，通过细胞自身代谢对全转录组RNA m6A位点进行标记，标记位点可发生化学处理诱导的逆转录碱基突变，进而实现单碱基分辨率测定。

细胞内S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基转移酶的辅助因子，可在METTL3/METTL14的作用下，将其甲基转移到mRNA上的特定腺嘌呤的N6位点形成m6A。SAM是以甲硫氨酸和ATP为原料，在甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）的催化下合成的。

刘建钊课题组从甲基化源头考虑，引入带有烯丙基修饰的甲硫氨酸，在细胞内MAT作用下生成烯丙基取代的辅助因子allyl-SAM或者硒代同源物allyl-SeAM 。METTL3/METTL14利用allyl-SAM或allyl-SeAM，将其烯丙基修饰到mRNA上原本是m6A的位点，得到a6A（N6-烯丙基腺嘌呤），a6A在温和的碘加成条件下诱导生成环化1,6位环化腺嘌呤(cyc-A)，然后，RNA cyc-A在逆转录成互补DNA（cDNA）时发生碱基错配。

最后，通过生信分析突变位点，得到了全转录组m6A位点的单碱基分辨率图谱。

同时期同杂志上，北京大学贾桂芳课题组发表Antibody-free enzyme-assisted chemical approach for detection of N6-methyladenosin的研究论文。

贾桂芳课题组巧妙地利用FTO作为催化剂，惰性的m6A修饰转化为高反应活性的中间态产物N6-羟甲基腺嘌呤（hm6A），然后利用二硫苏糖醇（DTT）的巯基与hm6A发生亚胺1,2加成反应，将不稳定的hm6A转化为更稳定的巯基加成产物dm6A。dm6A上的自由巯基可以与甲烷硫代磺酸（MTSEA）快速反应，在m6A修饰的碱基加上生物素Biotin，最终可被链霉亲和素珠捕获。

点评：

没有点儿化学基础，不要轻易尝试开发测序的方法学研究，跟着大佬吃尾气就行了

8 circRNA等领域向m6A入侵

内搭布拉斯大学医学中心的Yan W课题组在Cell Research发表了题为m6A-dependent biogenesis of circular RNAs in male germ cells的研究论文。

本研究报道了在小鼠精子发生过程中，当后期粗线期精母细胞发育成圆形，然后伸长精母细胞时，大量的circRNA会被合成，且含量不断增加。

这项研究不仅发现了m6A在编码circRNA的生物发生中的新作用，而且发现了在没有线性mRNA的情况下，通过产生含有大ORF的circRNAs和反向剪切位点附近序列中m6A修饰的起始密码子，确保稳定持久的蛋白质产生的潜在机制。

2020年6月，郑大一附院的孙振强教授在Molecular Cancer对最近circRNA m6A修饰一些研究现状发表The role of N6-methyladenosine (m6A) modification in the regulation of circRNAs论文，总结了m6A修饰在circRNA调控和功能中的作用。此外，还讨论了该领域的潜在应用和未来方向。

全文总结
    

常规的m6A套路为：

甲基化转移酶/去甲基化酶差异

↓

阅读蛋白差异

↓

靶基因修饰出现变化

↓

RNA水平或蛋白水平出现变化

↓

对应表型及通路变化

所以严格按照这个套路来，基本上一套实验下来，发一个Molecular Cancer级别的杂志问题不大，再不济的话Cell Death & Differentiation和Molecular Therapy等杂志也是可以考虑的。植物方面，Plant Cell、Nature Plant、New Phytologist等杂志也非常欢迎植物相关的m6A修饰研究。

但是要出彩的话，需要从一个新的领域去攻入。例如在今年1月，何川课题组与中科院北京基因组研究所的韩大力课题组及同济大学的高亚威课题组合作，首次发现m6A修饰能够调控染色质状态与转录，相关研究发表在Science主刊。

但是这类原创发现如同金矿一般，会越来越少，审稿人的角度也会越来越刁钻（或者说相关大佬们慢慢形成了自己的审稿圈子），没有特别亮眼的研究，只能陷入一个低level无限循环的怪圈。

跨圈子合作，如跟计算机材料等课题组合作，本身m6A也已经沦为了配角，占据论文的第一完成单位也希望渺茫。除非领域内长达多年未解决的问题，从m6A的角度去攻入，倒是有一定希望冲击主刊甚至是20分以上的子刊。

总结下来，m6A研究开始从淘金时代（2011年之前），到铂金时代（2012年-2015年），再到黄金时代（2015-2018年），以及当下的白银时代（2018-2020），后面极有可能进入黄铜时代。

做一个不负责任的预测，后期方向极有可能在跨学科或者至少是一些跨细分领域的合作，才有冲击主刊的希望。而普通的m6A研究在一套完整逻辑指导下，10多分的生化综合期刊以及20多分的临床期刊问题不大。对于一般的吃瓜群众，创新性不强，follow其他研究方向的论文，会大概率聚集在6-8分级别的杂志。

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