摘要
最新发现的急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)因其高传播率和高死亡率已造成了全球紧急事件卫生。宿主与病毒基因组RNA相互作用的分子机制尚不清楚。我们证明了SARS-CoV-2基因组RNA作为负调控意义的RNA在人类和猴子细胞中动态修饰m6A。结合RIP-seq和miCLIP分析，在基因组中共鉴定出8个单碱基分辨率的m6A位点。特别是已鉴定出m6A位点发生突变的流行株已经在世界范围内出现，并在美国形成了一个独特的聚类。进一步功能实验表明，m6A甲基化负调控SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2感染还引发了宿主m6A甲基化的普遍增加，显示出mRNA中m6A甲基化定位和基序的改变。总之，我们的结果确定了m6A作为介导病毒-宿主相互作用的动态外转录组标记。
2019年12月以来，新型冠状病毒2019 (COVID-19)在全球迅速蔓延。截至2020年12月21日，世卫组织已报告了75,704,857例COVID-19确诊病例，包括1,690,061例死亡。COVID-19是由一种名为SARS-CoV-2的新型冠状病毒引起的。虽然正在研制预防病毒感染和治疗该病的疫苗和抗病毒药物，但对病毒和宿主之间的相互作用知之甚少。冠状病毒是广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类的包膜RNA病毒，可引起急性和持续性感染。所有冠状病毒可分为四属: α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒。新出现的SARS- CoV -2与另外两种高致病性人类冠状病毒SARS和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)都属于β冠状病毒。SARS-CoV-2具有一个长度约30kb的单链正义基因组RNA。SARS-CoV-2进入细胞后，病毒基因组被释放，翻译成病毒复制蛋白，然后被宿主蛋白酶加工。全长负义模板由正义基因组RNA合成，并作为子代病毒RNA合成的模板。亚基因组负义模板也由不连续转录合成，并作为mRNA合成的模板。与其他冠状病毒一样，SARS-CoV-2的基因组有一个标准的真核5'末端帽子结构和一个3'多聚腺苷酸尾。已证明，冠状病毒的帽状结构和2'-O-MTase甲基化等转录组修饰可以通过阻断5'-3'外核糖核酸酶的降解来稳定冠状病毒RNA，并逃避宿主RNA传感器的识别或抵抗干扰素(IFN)介导的抗病毒应答。然而，SARS-CoV-2病毒基因组是否存在任何内部修饰尚不清楚。m6A也长期被发现存在于病毒的RNA转录本中，近期研究表明，HIV和ZIKV病毒RNA中的m6A修饰可调节病毒基因表达，影响病毒复制。然而，人们对m6A在包括新发现的SARS-CoV-2在内的冠状病毒中的分布、功能和调节机制知之甚少。在这项研究中，我们在人类和猴子细胞中检测了SARS-CoV-2的m6A甲基化，发现m6A广泛分布于阳性和阴性的SARS-CoV-2 RNA中。特别是，世界范围内出现了数百种m6A基序突变的流行毒株。病毒感染触发关键修饰酶从细胞核转移到细胞质，m6A METTL3/14和erase ALKBH5分别负调控和正调控SARS-CoV-2复制。SARS-CoV-2复制对m6A读取器YTHDF2也敏感。我们还发现SARS-CoV-2感染改变了宿主m6A的甲基化，表明m6A参与了宿主-病毒的相互作用。
总之，我们的研究结果指出了SARS-CoV-2感染过程中的宿主和病毒m6A甲基化水平的变化，突出了m6A在SARS-CoV-2传播和发病过程中的潜在作用。1. SARS-CoV-2基因组RNA中m6A甲基化为研究SARS-CoV-2基因组RNA是否被m6A甲基化，本研究采用了对SARS-CoV-2敏感的非洲绿猴肾细胞株Vero和人肝癌细胞株Huh7。正如预期，SARS-CoV-2病毒RNA在SARS-CoV-2感染后迅速在Vero细胞中增殖(图1a)。SARS-CoV-2特异性单克隆抗体免疫荧光检测结果显示，随着感染时间的延长，病毒感染细胞的比例逐渐增加，在感染后56h，病毒感染细胞的比例接近100%(图1b)。SARS-CoV-2的m6A甲基化的序列结构最初由RNA免疫沉淀和高通量测序(RIP-seq)测定。从Vero细胞上清中提取的总RNA片段成100-200 nt，用m6A抗体免疫沉淀富集m6A标记的转录本(见材料和方法)。对SARS-CoV-2 RNA进行深度测序，以对照(24 h为~1100-2500×，56 h为~43000-60000 ×)和免疫沉淀(24 h为~40-80×，56 h为~1400-1900×)检测潜在的m6A信号。作为阳性对照，成功富集28S rRNA 4190位已知m6A位点(补充信息，图S1a); 两个生物重复之间的相关性高(0.9947)，表明我们的方法具有良好的重现性。在24h的SARS-CoV-2基因组中有4个可信的m6A峰(图1c)，而在56 h的SARS-CoV-2全长基因组RNA中检测到另外9个可信的m6A峰(图1d)，表明m6A发生在感染后期。所有在Vero细胞鉴定出的m6A峰均通过m6A-IP-qPCR进行验证。SARS-CoV-2在56 h时的m6A强度高于24 h时的m6A强度。在受SARS-CoV-2感染的Huh7细胞中，用RIP-seq进一步验证，在120 h时SARS-CoV-2基因组RNA中检测到6个可靠的m6A峰，所有这些峰都与在56h时SARS-CoV-2感染的Vero细胞中检测到的m6A峰重叠。这些数据表明，在宿主细胞感染SARS-CoV-2期间，SARS-CoV-2 RNA逐渐m6A甲基化。 图1 SARS-CoV-2阳性基因组RNA中m6A甲基化的分布。a Vero细胞被SARS-CoV-2感染。6、24、56 h后取上清，qRT-PCR检测SARS-CoV-2 RNA。n=3。b 不同时间点(6h、24h、56h) SARS-CoV-2感染Vero细胞(S蛋白，绿色)和细胞核(DAPI，蓝色)的代表性图片。刻度条，20µm。c, d 从Vero细胞24 h (c)和56 h (d)处采集的SARS-CoV-2 RNA的精制RIP-seq显示了SARS-CoV2基因组上m6A reads的分布(红线)。灰线表示输入样本的基线信号，沿x轴的绿色矩形表示m6A峰。数据代表n=2个决定。e miCLIP发现SARS-CoV-2全基因组单碱基分辨率的m6A位点。miCLIP输入样本与免疫沉淀样本的c -t转换比例，RIP-seq免疫沉淀样本的SARS-CoV-2 reads分布分别用灰线、红线、粉线表示。绿色的点表示m6A位点，该位点位于已鉴定的m6A峰内，并且在两个miCLIP生物学重复中都被鉴定。SARSCoV-2基因组示意图如下所示，显示了m6A富集序列的位置。为了在单碱基分辨率下确定确切的m6A修饰，在受SARS-CoV-2感染的Vero细胞中进行了m6A单核苷酸分辨率交联和免疫沉淀(miCLIP)试验。我们还获得了较高的测序深度(免疫沉淀和输入样本的测序深度分别为~ 2450000 ×和~ 160000 ×)，以提高miCLIP实验的可信度。例如，m6A位点的C-T转换速率明显高于对照(Fig. 2a)， miCLIP鉴定的宿主m6A位点和m6A位点的共有基序在Vero细胞中的分布与之前的文献报道相同。在每个生物重复中分别鉴定出12个和11个单碱基m6A位点(图1e)，共有11个m6A位点。其中8个m6A位点与RIP-seq识别出的m6A峰重叠(图2a中绿色点标记); 因此，它们被用于下一步的分析。然后我们根据参照基因组示意图分析了m6A位点。我们发现ORF1ab中有3个m6A位点，ORF 7a中有1个m6A位点，N中有3个m6A位点，ORF 10中有1个m6A位点。因此，m6A的修饰更倾向于发生在病毒基因组的3 '端。SARS-CoV-2流行毒株m6A位点突变与先前发现的m6A峰在人体组织中的SNPs富集一致，SARS-CoV-2的m6A位点也在SNPs中富集: 随着m6A位点的增加，SNPs的数量减少，表明目前SARS-CoV-2分离株中m6A相对保守。然而，在SARS-CoV-2的全球传播过程中，最近发现了一系列可能影响病毒传播和致病性的突变。除正义病毒基因组外，负义RNA中间体也是合成正义基因组RNA和亚基因组RNA的重要模板。在我们的RIP-seq数据中，SARS-CoV-2的负义RNA占正义基因组RNA的测序reads不到1%(图3a)，这与它的媒介作用一致。由于我们采用的模板转换反应的方向性，我们保留了原RNA的链方向，让我们能够区分m6A信号在正义RNA还是反义RNA中。我们能够在 24 h 从感染 SARS-CoV-2 的 vero 细胞中收集的反义 RNA 的 5' 末端识别出 1个 m6A 峰(图3b)。在56 h总测序reads中发现SARS-CoV-2 RNA反义的比例相似，在反义的SARS-CoV-2 RNA中还发现8个m6A信号(图3c, d)，说明m6A也普遍存在于反义RNA中。由于反义RNA的覆盖面有限，我们无法通过miCLIP确定高可信度的m6A位点。然而，我们的研究结果清楚地表明，SARS-CoV-2的反义RNA在病毒感染过程中也动态地甲基化了m6A。 图2不同SARS-CoV-2分离株中m6A的替换。a 序列比较由python和Biopython包执行。EPI_ISL_424359(蓝色)被设置为引用序列。本研究中使用的当代SARS-CoV-2毒株用黑色和红色标记。变异是根据它们在病毒基因组中的位置而呈现的。b 在m6A修饰位点1、3、4、6处发生突变的289株菌株的样本分布，每个点代表一个样本，用R用ggplot2包绘制。大部分突变株分布在欧洲和北美。c 使用IQ-TREE估计的最大似然系统发育树。最终的结果是由ggtree可视化的。以EPI_ISL_424359株为参考株，推测核苷酸的保守变化。7个GISAID支系(L、S、G、GH、GR、O、V)的病毒序列和大陆信息以不同颜色显示。m6A突变株的位点位置用箭头表示，箭头上分别为绿色(Site 1)、紫色(Site 3)、黄色(Site 4)和蓝色(Site 6)。树的详细信息见补充信息表S4。图3 SARS-CoV-2阴性RNA m6A甲基化结构a 24 h时从Vero细胞中收获的SARSCoV-2阳性和阴性RNA的比例。b RIP-seq从SARS-CoV-2感染的Vero细胞中分离的阴性RNA在24 h时鉴定的m6A峰图谱。读取覆盖率归一化为每个实验映射到病毒阴性RNA的读取总数。蓝线为SARS-CoV-2负感RNA对应的m6A reads的分布，灰线为输入样本RNA-seq信号的基线信号。m6A的峰沿x轴以黄色矩形表示。c sars - cov -2感染Vero细胞56 h时阳性和阴性RNA比例。d m6A reads定位于从SARS-CoV-2感染的Vero细胞中提取的SARS-CoV-2阴性感觉RNA (56 h)。数据代表n=2个决定。蓝线为SARS-CoV-2负感RNA对应m6A reads的分布，灰线为输入样本的基线信号。m6A的峰沿x轴以黄色矩形表示。m6A RNA甲基化负调控SARS-CoV-2基因的生命周期a分别敲除m6A甲基转移酶(METTL3/14)、去甲基化酶(ALKBH5)和解读蛋白(YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3)后的sars - cov -2感染Huh7细胞的免疫荧光图像。以METTL3/14和ALKBH5为靶向siRNA处理Huh7细胞，同时以非靶向siRNA为阴性对照，以0.05 MOI感染SARS-CoV-2 72 h，使用识别SARS-CoV-2 S蛋白的特异性抗体(绿色);DNA用DAPI染色(蓝色)。刻度条，20µm。b a. n= 3时病毒S蛋白阳性细胞的百分比。差异的统计学意义由学生的非配对t检验确定。* P < 0.05;* * * P < 0.001;ns,非重要。c siRNA处理细胞中SARS-CoV-2相对RNA拷贝数在72 hpi时通过qRT-PCR定量。RNA用GAPDH标准化。n = 3。所有数据均为所示重复次数的平均值±标准差。差异的统计学意义由学生的非配对t检验确定。* * P < 0.01;* * * P < 0.001;* * * * P < 0.0001;ns,无足轻重的。d在72 hpi时用qRT-PCR定量siRNA处理的上清液中释放的SARS-CoV-2 RNA。n = 3。所有数据均为所示重复次数的平均值±标准差。差异的统计学意义由学生的非配对t检验确定。* P < 0.05;* * P < 0.01;ns,非重要。图5 SARS-CoV-2感染对Huh7细胞转录本m6A甲基化的影响。a在未感染细胞(蓝线)和感染sars - cov -2的Huh7细胞(红线)中富集的m6A峰沿RNA片段的分布进行分析。每个片段按照Refseq注释中的平均长度进行归一化。Barplot显示了m6A峰在指示区域的百分比。b在宿主细胞RNA转录本的5 ' UTR(橙色)、CDS(蓝色)、3 ' UTR(红色)和ncRNA(绿色)中获得的m6A峰(顶部)和丢失的m6A峰(底部)的分布图。Huh7细胞未感染或SARS-CoV-2感染，感染120 h后检测细胞总RNA m6A峰。代表n=2个决定。c MA图显示了SARS-CoV-2感染前后干扰素刺激基因m6A峰值强度的变化。在SARS-CoV-2感染时，干扰素刺激的基因m6A峰值强度变化不明显，m6A峰值强度高，m6A峰值强度低，分别为灰点、红点和蓝点。d对m6A峰下调(左)和m6A峰上调(右)基因的GO富集分析。e基序分析识别丢失m6A峰的一致序列(左)和获得m6A峰(右)。每一个的前四个主题都显示出来了尽管对SARS-CoV-2的全面了解至关重要，但SARS-CoV-2的转录后修饰尚不清楚。在这项研究中，我们首次提供了SARS-CoV-2 m6A甲基化的转录组范围特征。我们发现m6A在正义基因组和负义RNA中间体中分布广泛，并被动态调控。同时，也发现了数百个m6A基序突变的流行毒株。研究发现，m6A和m6A甲基转移酶和去甲基化酶参与了病毒生命周期调控。此外，YTHDF2负调控SARS-CoV-2的复制。YTHDF2对m6a标记转录本的衰减有文献记载的作用。此外我们发现宿主m6A甲基化包括m6A位置和甲基化基序在SARS-CoV-2感染后发生改变。总之，我们的研究表明，在SARS-CoV-2中，m6A的转录组标记是广泛且动态调控的。m6A及其解读器蛋白在病毒感染过程中有多种作用;到目前为止，还没有关于m6A在冠状病毒生命周期调控中的作用的报道。
SARS-CoV-2病毒感染引发了宿主细胞中m6A甲基化的重编程。我们发现m6A作为SARS-CoV-2复制的负调控因子，这为疫苗和抗病毒药物的开发提供了潜在的新策略。一方面，可以通过反向遗传途径提高m6A修饰水平来设计减毒疫苗毒株。利用miCLIP，我们在碱基分辨率上确定了几个候选m6A位点;它们是一个子集还是全部在调节病毒感染方面发挥作用还有待确定。然而，m6A关键位点可用于设计减毒疫苗株。另一方面，m6A修饰机制可以为抗病毒治疗提供新的靶点。
我们的研究表明m6A RNA修饰在新型冠状病毒-2中普遍存在。并强调了SARS-CoV-2对生命周期的一个外胚层调控及其对SARS-CoV-2传播和致病性的潜在影响。这些知识可以促进基于m6A转录后修饰的新抗病毒药物的开发，并为通过操纵m6A标记设计减毒疫苗毒株铺平道路。点击下方图片进入云平台资料汇总：
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