这篇何川教授作为编辑/审稿人的微量m6A测序方法学究竟有哪些玄机? | m6A专题

      PLoS Biology曾经刊登过一篇介绍m6A测序方法学，尤其涉及到微量total RNA起始量的条件测试，将m6A测序从高起始量彻底进入了微量m6A时代。通讯作者是加拿大多伦多大学的何厚胜教授。

      值得注意的是，这篇文章审稿的编辑正是芝加哥大学何川教授本人。

      那么这篇文章所呈现的一些关键信息究竟有哪些重点值得我们去探讨呢？

1. 建库试剂盒大有来头

      联川小编曾经在2018年写过一篇稿子，对当时可能主流的m6A测序方法中涉及到RNA起始量需要哪些特殊建库方式做了罗列（300ng就能做m6A测序？RNA起始量究竟能有多低？）。其中针对低起始量的RNA有包括smart、进阶版smart（rRNA去除）、T7扩增以及Anydeplete扩增技术等。

      尽管这些技术有着不错的应用场景，但是面对超低起始量的RNA用于IP，实际上后期的错误会被无限放大。其实最为关键的是抗体IP前的RNA究竟还剩多少。

      无论是去除核糖体RNA（rRNA）还是采用polyA富集的方法，理论上1μg的total RNA去除rRNA后应该仅剩不到30~40ng的RNA，而polyA富集后预计仅剩的RNA约为10~15ng。这些不到50ng的RNA再进行m6A抗体的IP，预计IP洗脱后纯化完了的RNA不到100pg。100pg级别的RNA想要实现大量扩增，采用方法包括smart配合六碱基随机引物，增加PCR循环数超过15个，T7扩增法。

      根据已查阅的文献来看，目前基于smart技术延伸的方法有多种。其中于舒洋/杨运桂/叶丽林三位教授合作发表在Nature Communications上关于T Helper Cell的m6A文章中，就使用到了CloneTech的SMARTer smRNA-seq kit这款试剂盒。当然这款试剂盒在其他微量的m6A测序文章中均有报道。

      由于miCLIP-seq后续用于建库的起始量本身就较低，且RNA片段较短，可以使用这款试剂盒。这款试剂盒最大的特点就是对超微量的RNA先带上polyA的结构，然后进行smart扩增。

      实际上m6A在IP这一步放大误差可能性较大，所以理论上用于IP的RNA起始量不能特别低。这就引出了我们今天要讨论的话题那就是，如何在低起始量情况下尽可能的增加用于IP的RNA起始量呢？

答案是连带着rRNA一起用于IP，而不是仅仅富集polyA RNA或rRNA-removal RNA！

      在本次讨论的这篇PLoS Biology文章中，何厚胜教授团队所使用的也是CloneTech试剂盒，只不过从smRNA-seq替换成了CloneTech的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit (Pico Input Mammalian)。而且何教授也在文章中解释到，这个试剂盒关键点在于先对能够rRNA反转录的cDNA使用探针去除，这就使得增加m6A IP的RNA起始量成为了可能。这种方法由于不需要先进行rRNA去除或polyA富集，这使得这些前期容易对原始RNA损耗产生巨大影响步骤得以避免。换句话说，前期眉毛胡子一把抓，后期再把rRNA去除的过程中产生的损耗比如前期那么巨大。

      所以我们可以看到在rRNA的cDNA Probe探针以及ZapR酶的作用下，这些被反转录成cDNA的rRNA序列照样能够被消除掉。所以m6A的IP步骤前期可以将mRNA、lncRNA以及rRNA一起IP下来后直接进行smart扩增，然后再把smart扩增产物中的rRNA的cDNA序列给降解掉，剩下的RNA用于建库。

      综上所述，采用CloneTech的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit (Pico Input Mammalian)这款试剂盒绝对是目前微量m6A建库最好的方法之一。联川微量m6A所采用的建库试剂盒也是基于CloneTech这款SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit (Pico Input Mammalian)。

2. 不同RNA起始量对m6A测序常规质控结果的影响

      何厚胜教授这篇文章对于不同RNA起始量（2μg、6μg、12μg、32μg total RNA四种不同起始量）对应的一些生信分析常规参数进行了横向对比后发现，32μg的peak数量最高，当测序深度达到20M reads后32μg那组peak数量能够突破12,000个，而对应的2μg以及0.5μg我们会发现peak数量在测序深度超过10M reads后基本上分别为8,000个和6,000个左右。

      再回到Peak的共有交集上，我们发现32μg的unique peak数量最多，随着total RNA起始量降低，unique peak数量也是越来越少。回到具体的数据来看，一些unique peak除了低丰度的噪音外还有一些本身本底表达和修饰程度中低水平的 基因，而一些高丰度的m6A修饰的基因基本上影响不大。

      所以我们认为，后期在挖掘m6A微量测序数据上，我们尽可能需要选择一些丰度较高的基因作为候选验证基因，尽量规避低丰度的基因和部分噪音信号。

3. 总结

    总之，CloneTech的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit (Pico Input Mammalian)这款试剂盒对于哺乳动物来讲，是目前微量m6A建库的最佳试剂盒之一。后期生信数据呈现上，尽管数据质控结果无法达到常规m6A起始量那么完美，但是也请大家尽量选择高丰度的一些修饰基因用于后期的数据挖掘。

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