都2021年了整体m6A水平没差异也能做m6A测序 | m6A专题

小伙伴一开始肯定会有一个疑问，为何以前的m6A研究几乎所有文章都要对m6A一些关键指标进行检测。我们来看下曾经前几年m6A测序的一些基本套路，包括：

a. 大量样本检测m6A酶的差异，先锁定writers或erasers，再锁定readers

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b. 整体m6A水平差异检测（质谱、dot blot、酶标仪等）

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c. 挑选部分组织进行m6A测序

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d. m6A酶敲除敲低或过表达writers/erasers的细胞、动物或植物突变体表型实验

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e. 步骤d中的样本用于m6A测序，通常为细胞系稳转株或转染的转基因植物

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步骤c和步骤e中的m6A测序数据挖掘，锚定关键靶基因

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f. 靶基因上下调对表型影响，并且跟m6A修饰相关

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g. 具体reader调控带m6A修饰的靶基因，一系列表型实验验证

所以一般前期会对total RNA或mRNA的整体m6A甲基化水平进行检测的同时，尽量在甲基化转移酶writers或去甲基化酶erasers中找到一个关键酶，继而再引出阅读蛋白作为下游调控的关键角色。

这里面包括对m6A相关的甲基化转移酶（也叫Writers）、去甲基化酶（也叫Erasers）的转录水平和蛋白水平进行检测，低通量的验证手段包括常见的qPCR、免疫组化、WB等，高通量则包括转录组测序、表达谱芯片等。

但是时代变了，目前越来越多的验证证实，即便是整体m6A水平没有变化，甲基化酶也没有特别明显的变化，事实上也是能够继续开展m6A测序以及下游实验的。其中核心要素分为几个关键信息就能满足。即便m6A整体水平不差异也能继续进行后续的m6A测序及验证实验：

a. 整体m6A水平无差异，具体极个别感兴趣的mRNA和lncRNA的m6A水平也没有差异，但是reader蛋白有差异

b. 整体m6A水平无差异，具体极个别感兴趣的mRNA和lncRNA在m6A水平上两个比较组之间有差异

c. 整体m6A水平无差异，具体极个别感兴趣的mRNA和lncRNA的m6A水平甚至是reader也没有差异，但是强行去敲低和过表达各类m6A酶

接下来我们就用几篇典型的案例来告诉大家。

1. 草莓m6A修饰调控ABA通路介导果实成熟机制 （点击链接阅读详情）

在这篇文章中，秦国政课题组在研究m6A修饰对非呼吸跃变型果实成熟调控研究中，以草莓作为模式物种进行深入探讨发现，草莓果实中本身存在大量且普遍的m6A修饰。

但是在研究草莓成熟过程中，秦国政课题组使用液相质谱LC-MS/MS对草莓RNA进行整体m6A水平进行检测后发现，在成熟的三个阶段并没出现任何差异。作者推测一些高甲基化和低甲基化的基因存在动态平衡，导致样本之间整体水平差异不大，被相互抵消了。这就表明即便是整体m6A水平差异不大，也是往下继续测序的，而且需要锚定到具体感兴趣的基因！

成熟果实一些特异性m6A峰大多与植物发育相关，包括对激素刺激的反应、发育过程、组蛋白修饰、小分子生物合成过程和蛋白质运输。相反除了发育途径外，具有非差异m6A峰的基因在多种生物过程中富集。这些结果表明，m6A基因修饰的动态变化是这些基因在果实发育和成熟过程中发挥功能的主要原因。

值得注意的是，数百个催熟诱导和催熟抑制基因，其在RS1中的表达显著高于或低于S6，表现出差异m6A修饰。通过GO富集分析发现这些基因在组织发育、核质转运等过程中富集，暗示m6A甲基化参与草莓果实成熟的调控。

所以，总结下来就是成熟的不同阶段尽管RNA整体m6A水平差异不大，但是具体的一些基因的m6A差异水平相差巨大。

2. m6A甲基化和YTHDF1在树突状细胞中控制抗肿瘤免疫 （点击链接阅读详情）

已知在免疫微环境中，抗原呈递细胞诸如巨噬细胞和DC细胞等是激活杀伤性T细胞（CTL）的关键角色之一。而YTHDF1阳性且带有m6A修饰是限制DC细胞交叉呈递能力的关键因素，且DC细胞抗原表达能力更弱。

在这篇Nature主刊中，韩大力、徐萌等对FLT3L树突状细胞进行了YTHDF1-RIP-seq、m6A-seq和翻译组测序（Ribosome Profiling）。结果表明，RIP-seq和m6A-seq的数据主要富集在基因3’ UTR区域，ythdf1-/-树突状细胞的翻译效率显著低于WT树突状细胞，但是YTHDF1缺失并没有改变mRNA整体的m6A水平。

所以在这篇文章中，作者并不会因为m6A水平无差异就不进行m6A测序。因为涉及到溶酶体等关键mRNA即便是整体m6A水平无差异，也会被YTHDF1识别继而影响抗原呈递细胞与T细胞的通讯。

通过这个案例我们可以得知，一旦有自己感兴趣的一些基因或lncRNA，一定要关注是否带m6A修饰，两组间是否差异或两组间reader蛋白是否有差异。只要满足任意一个条件就能开展m6A测序。

3. YTHDF1影响肺小细胞癌的进展（点击链接阅读详情）

这篇文章中，YTHDF1这个阅读蛋白本身会影响肺癌细胞增殖。YTHDF1敲除后，事实上m6A水平并无显著变化。但是作者为何还要测m6A-seq、翻译组以及YTHDF1-RIP-seq呢？答案很简单，就在图p中。作者希望细胞周期的一些关键基因CDK2和CDK4上，既有m6A修饰信号也有YTHDF1的RIP信号。这就表明这些关键基因带m6A修饰同时被阅读蛋白YTHDF1给结合，继而行使下游功能。

果然后面作者通过m6A测序、翻译组测序、RIP-seq联合分析表明，CDK2和CDK4在可视化软件IGV中均观察到了m6A的Peak峰和YTHDF1的RIP-seq的Peak峰出现了重叠（IGV和Adobe AI制作RIP-seq Peak图简易教程 | m6A专题 ），YTHDF1敲除后翻译效率显著降低。

4. 头颈癌铁代谢机制（点击链接阅读详情）

浙江大学附属邵逸夫医院的叶荆等利用RIP-seq和m6A-seq联合分析揭示了头颈癌中的铁代谢机制。其中m6A测序结果表明YTHDF1敲除前后，样本中m6A水平并未出现显著差异。这时候作者对YTHDF1进行了YTHDF1-RIP-seq后挖掘到了>2000个 candidate靶基因。

对这些基因进一步通过GO、KEGG、GSEA分析后，逐步缩小范围并结合中山大学肿瘤防治中心左志向和郑健课题组开发的m6A2target数据库（m6A2Target:不做RIP也能预测m6A酶靶基因 | RIP专题）进行进一步交叉验证，逐步锁定到了TFRC。

m6A发挥作用的主要机制是由m6A结合蛋白决定的。TFRC的异位表达可部分恢复YTHDF1基因敲低细胞的生存能力和异种移植瘤生。TFRC的下调也导致YTHDF1诱导的细胞活力和迁移增加。这些结果强烈表明，TFRC是HPSCC细胞中YTHDF1的关键靶基因。

所以我们发现尽管敲低YTHDF1后整体m6A水平未能出现差异，还是能够锚定到关键的基因TFRC。

5. 总结

综上所述，即便是甲基化转移酶（也叫writers）和去甲基化酶（也叫erasers）无差异，继而引出另一个结论也就是整体m6A水平无差异（无论是质谱、dot blot还是酶标仪），都不影响我们继续往下做m6A测序。

最关键的是需要我们迅速锚定自己感性的基因是否发生了m6A水平差异，或者某个阅读蛋白reader差异后做RIP-seq并与m6A联合分析锚定到关键的基因，继而进行下游验证。在这里m6A测序的最大作用并不是挖掘差异m6A基因，而是告诉大家这个基因带m6A修饰，并被阅读蛋白调控行使对应功能。

所以，即便是整体m6A无差异，有感兴趣的基因，大家不妨大胆送样直接测m6A-seq吧！

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