学会这篇单细胞思路你也能愉快地教小师妹(附细胞marker基因) | 单细胞专题
Hello各位，暑假结束了，又该上演进了学校出不来，每到饭点一大群人隔着栏杆等待外卖小哥放饭的“铁窗泪”生活了。
并且此时，“包工头”极有可能开始问你要课题思路了。但是暑假撒欢都来不及，要啥自行车？
此时，你想必很着急，但作为21世纪的有素质有追求的新型科研农民工，如果还靠qPCR和WB，一条一条通路的不断在危险边缘试探，那你有不仅可能被后浪更可能被老板拍死在沙滩上。那如何快速有效的来少走弯头路呢？不妨用生物信息学为你来把把脉算算命吧！
在开始今天的主题之前，先打个广告，目前联川生物单细胞Marker基因In-House数据库LC-ACTM仍然在不断完善中，本篇文章中关于NK细胞的各种Marker已被收录进LC-ACTM。
作为2020年科研界的一大当红炸子鸡，单细胞测序就如同和谐号一般不断刷新着在各大顶刊的露面次数。因此，今天我们就以发表在Cell immunity上的一篇文章Single-Cell RNA Sequencing of Tumor-InfILtrating NK Cells Reveals that Inhibition of Transcription Factor HIF-1a Unleashes NK Cell Activity为例为大家解读如何利用单细胞测序来指导课题的走向。
科研的所有出发点在于发现问题，也就是从表型入手。HIF-1是具有转录活性的核蛋白，这个诺奖的明星分子具有相当广泛的靶基因谱。其中包括与缺氧适应、炎症发展及肿瘤生长等相关的近100种靶基因。
在这篇文章中，作者发现HIF-1α的敲除可以增强NK细胞的肿瘤杀伤能力，并且上调脾脏组织中NK细胞IFN-γ，Granzyme B和CD107a的表达水平。
但是究竟为什么HIF-1α敲除能导致NK细胞对肿瘤的杀伤能力上调的呢，作者搬出了单细胞测序。
从小鼠肿瘤组织中取野生型NK细胞3075个，再挑出2646个HIF-1α敲除的NK细胞进行上机后发现，两个样本的NK细胞有明显异质性，且可根据基因表达模式的不同可被分为Cluster 6，其中第Cluster 1和Cluster 4属于HIF-1α敲除型NK细胞。将cluster1和Cluster 4单独进行分析，可以发现这两群细胞具有较高的Ifng和Cd69表达。
Ifng和cd69均为免疫以及促炎相关基因，因此作者进一步猜测，这部分Ifng和cd69高表达的NK细胞（Cluster 4）是不是也具有较高的促炎能力。
从通路富集结果中可以看到敲除HIF-1α可以导致NF-κb相关通路的表达谱发生变化。对单细胞测序结果进行进一步分析显示HIF-1α敲除的NK细胞具有更高的NF-κB表达，并促进NF-κB下游的基因表达。
通过流式分选验证后，进一步从蛋白层面表明了HIF-1α敲除上调了NK细胞内NF-κB的表达水平。
接着，问题又来了，HIF-1α敲除是如何通过上调NK细胞内的炎症反应来介导抗肿瘤活性的呢？作者将肿瘤细胞注射进小鼠体内进行成瘤实验，通过qPCR发现肿瘤组织内免疫因子以及趋化因子的表达出现了变化，并且众多的免疫细胞内均出现了较大程度的炎症上游基因IL18的表达上调，提示IL18是不是在NK细胞发挥抗肿瘤过程及炎症反应中起着重要作用。
因此作者通过单细胞测序结果去验证这一猜想，果不其然，和正常细胞相比，具有更高抗肿瘤效果的HIF-1α敲除的NK细胞具有更高的IL18表达。因此作者一不做二不休，大胆假设，仔细推理，猜测IL-18在这过程中起着重要作用。通过IL18抗体将IL18受体阻断后发现，HIF-1α敲除型NK细胞内的炎症反应下调，并且NK细胞的抗肿瘤能力也大大下降。说明了HIF-1α敲除型NK细胞的抗肿瘤作用依赖于IL-18。
有了单细胞测序，在当下，靠以上这些数据发个10分不成问题。但是，作者为了冲击高分，必须结合体外验证，把机制做深，让人信服，无法反驳。
通过流式分选，将HIF-1α敲除型NK细胞培养在缺氧环境中。与体内实验一致的是，和正常培养的相比，缺氧培养的HIF-1α敲除细胞在IL12/18的共培养条件下具有更高的inf-γ表达水平和更高的NF-κB表达。而NF-κB的抑制剂能降低ifn-γ的表达。由于HIF-1α在抗缺氧环境中起着重要作用，因此作者进一步检测HIF-1α敲除对耗氧量的影响。从结果中可以明显发现，HIF-1α敲除明显上调了NK细胞内的耗氧量和产酸量。而ocr/ecar的比例能明显和ifn-γ呈正相关比例，提示ifn-γ的表达量上调和炎症反应的增强可能与HIF-1α敲除导致的耗氧量上调有关。
科研的进步是为了生命的延续，给病人一个体面活下去的机会。因此，光光动物实验是远远不够的，作者将视野放大到了其他肿瘤病人体内，去探究是否在其他病人体内是否也存在这种关系。从TCGA数据库中可以挖掘到，ifng和IL18这个基因还在黑色素瘤，乳腺癌和宫颈鳞癌中存在正相关的线性关系。并且在IL-18-IFNG高表达的NK细胞中相关转录本例如NCR1, NCR3, KLRB1, CD160, and PRF1也较高，并且NK细胞相关转录本-IL18-ifng的表达量还和病人的存活率成正相关趋势。
2020年，注定了是不平凡的一年，我们历经疫情历经洪水。我们还见证了5g元年的开启。此外，生物科技领域，2020年也将是会在史书上留下浓墨重彩的一笔，这一年，单细胞测序大爆发，通过这一测序利器，我们发现了多种肿瘤细胞的异质性，为治疗癌症献计献策，还通过单细胞测序发现了新冠感染过程中T细胞的作用机制。单细胞必将在2021年继续大放光彩，不断屠榜。那么，作为科研圈的一份子，还不赶紧乘着风口起飞？作为国内最早建立的一批测序公司，联川生物拥有深厚的研发能力以及一流的服务品质，想要发高分的高影响力的文章，联川是你最好的帮手，最好的合作伙伴。心动了吗？那还不赶紧把单细胞单子砸向我们？我们准备好了！
作者简介——
何炳楠博士，联川生物高级生物信息工程师。目前负责m6A甲基化、单细胞测序等相应数据分析和售后服务工作。擅长从生物化学角度来重新理解生信数据，语言风趣幽默。
接下来是联川讲堂时间：NK细胞具有抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节的作用，因此在体内发挥着重要的作用。那你知道，NK细胞具有多重分化状态才能变成具有实际功能的成熟NK细胞吗？现在让何博为你揭秘如何在单细胞测序中如何鉴定不同分化阶段的NK细胞。这些数据均收录在联川的LC-ACTM 数据库中。
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