【血浆蛋白组】PEA技术与基于质谱的蛋白检测技术的互补性研究 | Olink蛋白质组学

核心摘要：在2020年11月30日《Journal of Proteome Research》杂志的一篇方法学互补性研究中，来自德国Helmholtz Zentrum München 的Stefanie M. Hauck团队，综合比较了血浆蛋白质组学的三个平台方法，探讨了Olink PEA邻位延伸技术与基于质谱MS的DDA、DIA蛋白质检测技术的互补性。研究者们采用德国南部人群队列的173份人血浆样本作为目标检测样本，分别对比测试了基于质谱MS的DDA-MS、DIA-MS两种采集模式，以及PEA邻位延伸技术（Olink专利技术）检测血浆中游离蛋白的性能。通过对比测试得到的结果如下：

PEA在“检出蛋白数”、“重现性”方面综合显著优于DDA、DIA

• 全部样本中累加检出蛋白数：PEA为736个，DDA-MS仅为368个，DIA- MS为734个；

• 25%以上样本重现检出蛋白数：PEA为728个，DDA-MS为329个，DIA-MS仅为379个；

• 25%以上样本重现检出蛋白率：PEA为98.9%，DDA-MS为89.4%，DIA- MS仅为51.6%

PEA的细胞表面蛋白更多：

PEA最高，超过20%；DIA，DDA均低于15%。

三种方法重叠覆盖的蛋白占比极低：

PEA，DDA，DIA三种技术均重叠覆盖的蛋白仅35个，占所有蛋白比例小于5%。说明这三种不同方法间有很强的互补性，通过方法学协同，可以更全面地看到血浆蛋白组的全貌。

PEA的检测灵敏度显著优于DDA、DIA：

PEA与DDA、DIA等基于MS的方法最大的不同，在于灵敏度，表现为对低丰度的蛋白生物标志物的检测能力。本文研究者利用PEA检测到了数十个白介素和趋化因子等低丰度蛋白，而利用MS仅检测到2个趋化因子。长久以来，血浆蛋白组检测技术一直饱受检测灵敏度、通量、数据重现性等限制，使得在既往的涉及医学领域的队列中，对于蛋白组检测，往往采用的是器官组织类样本；而PEA技术的发展成熟，使得利用体液、无创样本进行队列研究变得越来越简单易行，同时PEA技术在血浆蛋白组检测中可以交付远优于DIA的的数据重现性、远优于DDA的检测覆盖度—这对于队列研究来说，无疑是极为重要的。当然，从这篇文献中也可以看到，把PEA和MS技术结合起来，可能可以更全面地看到蛋白组的全貌。同时，业内逐渐形成一种视角：组织等蛋白丰度较高的样本更适合于MS，血浆等蛋白丰度较低的体液类样本更适合于PEA。同时，2021年6月23日，Olink正式宣布将其蛋白组检测通量扩大到3072个生物标志物/样本，从而以实现对于重要信号通路100%的覆盖率。从现在起，一个兼顾灵敏度、检测通量、通路覆盖度等各个维度的、生物功能意义上无偏的血浆蛋白组技术，已成为现实。以下为文献的详细解读，需要十分钟左右时间阅读

概述：

        血浆是生物标志物发现的首选体液之一，其具有良好的可获得性和丰富的蛋白质组成，且真实反映了生物体的病理生理学状态。目前，实验室临床检测的样本绝大部分是基于血浆中循环蛋白质，这也表明了血浆蛋白质组在临床诊断中的重要性。然而，血浆是分析难度最大的样本之一，分析的主要难点，是来自血浆中高峰度蛋白造成的。人血白蛋白含量最高，约占血浆全部蛋白总质量的50%，而丰度前22位的蛋白，占血浆总蛋白质的99%以上。血浆蛋白质中种类有上万种，浓度动态范围超过10个数量级，为基于质谱(MS)的传统蛋白质组学平台带来了巨大的挑战。

       基于亲和的蛋白质组学技术在血浆蛋白质组学中受到越来越多的关注。邻位延伸分析技术(PEA)是由Olink蛋白质组学(Uppsala, Sweden) 开发的一项新兴技术，它将实时定量PCR和多重免疫分析结合在一起。PEA是通过一对特异性的抗体标记可以形成互补链的独特的DNA寡核苷酸，对目标生物标记物进行双重识别。在这里，生物标志物特异性DNA条形码通过微流控qPCR进行定量，允许使用几微升生物液体(1 μL用于92个生物标志物的定量)，从而实现对多达1161种人血浆蛋白进行高通量相对定量。使用多个内部控制来监控反应的每个步骤，能够全面控制分析和样品的技术性能。

       在本篇研究工作中，来自德国亥姆霍兹慕尼黑环境与健康研究中心的研究者们，目标是将PEA技术与DDA（Data Dependent Acquisition，数据依赖采集）和DIA（Data Independent Acquisition，数据非依赖采集）模式下的质谱方法作为基准，使用来自基于KORA 队列(奥格斯堡地区合作健康研究) 研究的173份血浆样本。对这些分析平台的性能进行了表征和定性比较，以探索血浆蛋白质组多平台研究的可能性。研究结果显示了PEA和非靶向LC MS/MS在临床相关样本血浆蛋白鉴定和定量方面的互补性，同时研究了每种技术的潜力和局限性。

实验设计：本研究共使用了来自德国南部人群的队列KORA的173份人血浆样本，其中包括男性90名，女性83名，年龄在62 - 74岁之间。KORA是由亥姆霍兹中心运营的一个研究平台，研究健康、疾病和人口生活条件之间的联系。主要关注糖尿病、心血管疾病、肺部疾病以及环境问题。样本进行随机处理，且在所有测量和初始分析步骤中，实验人员保持盲法。内部血浆池标准样本用于质谱和PEA测量，以确定分析内和分析间的方差系数。Olink PEA实验的阴性和阳性控制由制造商提供。

 质谱样本处理与数据收集

血浆样品使用试剂盒PreOmics iST Kit (PreOmics GmbH, Martinsried, Germany)制备。将5 μL的血浆用水1:10稀释，以5 μL的稀释物作为试剂盒的起始物。稀释后的血浆用裂解缓冲液裂解，随后使用胰蛋白酶酶解。肽被洗涤，从iST柱中洗脱，干燥。干燥后，在3% 乙腈(ACN)和0.5%三氟乙酸(TFA)中重悬。质谱数据分别在DIA模式和DDA模式进行收集，数据由Q Exactive HF 质谱仪(Thermo Fisher Scientific)上获得。每个样品大约0.5 μg被自动加载到在线耦合高效液相色谱系统中。

Olink PEA样本处理与数据收集

使用Olink基于PEA的8个Target 96 panel （C-MET、CVDII、CVDIII、ONCII、ONCIII、DEV、IMM和NEU panel）测定血浆中736个蛋白生物标志物的相对丰度。每组92个蛋白用1 μL血浆进行筛选。简单地说，每个蛋白质被特定的一对寡核苷酸标记的抗体作为目标，当两个寡核苷酸被放置在近距离时，DNA聚合事件产生一个特定的PCR产物，该产物被实时PCR检测和定量。对于每一次PEA测量，基于每次测试中包含的阴性对照计算检测限(LOD)，低于此限的测量将从进一步分析中删除。结果解析
1. 定性比较分析PEA与LC−MS / MS数据

         基准研究是对来自基于KORA队列中的173份血浆样本进行MS与PEA分析。利用PEA技术，筛选了736个蛋白生物标志物(图1A) 。其中3种蛋白(SCF、IL6和AREG) 在多个panel中都有测量，各个panel的测量结果显示，斯皮尔曼相关系数呈强正相关，范围从0.84到0.95。在25%以上的样品中检测到728个蛋白，超过90%的蛋白（666个）在所有的样本中均被检测出。使用标准的DDA-MS工作流程，在所有样本中共鉴定和定量了368个蛋白 (3042个肽段)，在超过25%的样本中测定了329种蛋白质。为了进行DIA-MS测量，研究者使用人类未高丰度去除的血浆和血清生成了一个全面的谱图数据库，其中包含1838种蛋白质(37,079种肽前体)。利用谱图数据库，在血浆样本中总共量化了734个蛋白质(12314个肽段)，在超过25%的样本中进行直接鉴定出379个蛋白质。使用PEA技术不但在鉴定蛋白数目上有优势，且在每个样本中，鉴定蛋白的重现性也非常好。

图1所示。(A) 通过PEA、DDA-MS和DIA-MS鉴定和定量的所有样本或超过25%的样本中测定的蛋白质数量。(B)经PEA、DDA-MS和DIA-MS鉴定的亚蛋白质组十个最重要生物学过程。 (C)每个平台鉴定蛋白GO富集分析

       不同平台鉴定出的蛋白质，在生物体中的功能性会有所区别吗？研究人员进一步对PEA、DDA-MS和DIA-MS靶向的亚蛋白质组进行了表征(图1B)。使用GO分类来探索每个分析平台中超过25%的样本中所鉴定的蛋白质所代表的生物过程。在PEA靶向亚蛋白组中富集程度最高的生物过程包括信号通路、免疫系统和生物粘附。其中，参与细胞表面受体信号通路的蛋白占筛选蛋白的40%以上。PEA技术的高灵敏度使得低丰度的蛋白质的测量成为可能，如白细胞介素和趋化因子，肽激素和包括TFG-alpha在内的生长因子。由于它们在稳态下的丰度极低，这些低分子量信号蛋白很难被MS检测到。MS仅测量到了两种趋化因子(血小板碱性蛋白，和血小板因子4)。

DDA和DIA-MS数据集中最具代表性的生物过程是免疫反应。免疫球蛋白(其中许多是重链和轻链免疫球蛋白的可变域)和补体因子通过MS检测(分别为DIA-MS和DDA-MS的107和101个蛋白ID)。如图1C所示，所有三个平台鉴定的近70%的蛋白质位于细胞外区域，这与检测的体液性质非常相关。MS亚蛋白质组主要集中在细胞-外泌体定位相关蛋白，大量的免疫球蛋白、凝血因子和补体蛋白，这些已知与细胞外囊泡相关。另一方面，与MS相比，PEA鉴定的细胞表面蛋白的比例增加了一倍，这反映了该方法更多关注的细胞信号通路。2. PEA、DDA-MS和DIA-MS鉴定的蛋白质重叠分析

         为了对三种分析平台鉴定的蛋白质进行可靠性的比较，研究者进一步对在超过25%的样本中检测到蛋白质进行重叠分析。如图2A所示，在DDA和DIA两种模式下，MS检测的总蛋白中有超过60%的重叠度(两种MS方法都鉴定出276个相同蛋白)。比较MS和PEA测量的蛋白质，有52种蛋白质同时被检测到。最有趣的是，在DDA和DIA模式下，MS也同时检测到了PEA靶向的35个蛋白(表1)。其中，PEA和MS之间的重叠蛋白主要是高丰度蛋白质。在PEA panel中，这些蛋白质需要血浆预稀释，如C-MET和CVD III(分别为23和7个蛋白质)。在使用未稀释血浆的其他panel中有5种蛋白质重叠(图2A)，在人血浆中也非常丰富，Olink蛋白质组学在生物标志物分析浓度范围的测量中证实了这一点。对重叠蛋白的STRING分析显示了其参与补体/活化级联反应的一簇蛋白质，且这些蛋白大多数蛋白位于细胞外区域。

图2所示。PEA、DDA-MS和DIA-MS对超过25%样品中检测到的蛋白质进行比较。(A) 通过PEA、DDA-MS和DIA-MS在25%以上的样本中检测到的蛋白质的维恩图。在8个Olink panel中35个重叠蛋白的分布(C-MET: 需要样品稀释1:2025; CVDIII: 稀释系数1:100; CVDII, ONCIII, DEV, 最后三个panel不需要样品稀释)。(B) 35个重叠蛋白的STRING分析。

      而未重叠的蛋白部分，有600多种PEA靶向蛋白未被MS检测到，而两种MS方法可以检测到380种独特血浆蛋白。如果将PEA与MS平台互补，可以获得了1104个蛋白质组的覆盖，这些蛋白质在人血浆中得到可靠的鉴定和定量。

3. 经PEA、DDA-MS和DIA-MS鉴定的重叠蛋白的平台重现性

       为了验证平台的互补性，研究者进一步在三个维度: 数据分布、相关性和基于变量的差异表达，研究重叠的35种蛋白在不同平台的重现性。

        首先，数据分布之间的相似性，采用非参数两样本Kolmogorov - Smirnov (KS)模型进行检验。通过Z分数转换(中心和缩放)，以评估数据总体分布形状，结果显示大多数重叠蛋白的分布在不同技术之间没有显著差异。

图3所示。35个重叠蛋白的数据分布。(A)非参数双样本Kolmogorov Smirnov (KS)检验z-score变换后的比例数据。直方图显示了平台间数据分布有显著或不显著差异的蛋白质数量。(B)小提琴曲线图的z分数转换比例数据显示了5个典型的重叠蛋白质的分布形状

       其次，相关性分析，使用DDA和DIA的MS测量对大多数蛋白质有相当的相关性 (23个蛋白与DDA-DIA  斯皮尔曼相关系数R >  0.5)。PEA的测量结果显示与DDA-MS的相关性大于DIA-MS，即分别有14和10蛋白斯皮尔曼相关系数R > 0.5。其中有6种蛋白质在三个平台中，呈中度正相关 (斯皮尔曼相关介于0.5和0.8)，2个蛋白呈高度正相关(斯皮尔曼相关 R > 0.8)。

          第三，基于变量的差异分析，由于队列中男性和女性的可比性比例(男性n = 90，女性n = 83)，研究者进行了基于性别特异性的差异表达分析。对平台内的所有蛋白质进行韦尔奇两样本t检验，然后采用Benjamini-Hochberg (FDR)多重检验校正，alpha水平为0.05。计算了在PEA数据集中有显著调控的130个蛋白质和在MS数据集中68个蛋白质，其中分别有16个和15个蛋白质在DDA和DIA-MS数据集中唯一存在。

倒置条形图显示了基于性别差异的分析平台之间的重叠。四个与性别显著相关的蛋白IGFBP6 (胰岛素样生长因子结合蛋白6)， F11(凝血因子XI)， PROC(维生素k依赖蛋白C)， SERPINA7(甲状腺结合球蛋白) ，在三个平台上的效应方向相同。虽然不能假定平台之间的效应大小具有完全相同的量级，但效应方向是生物学洞见可重复性的重要指标，即从所有平台上都可以推断出同样显著的上调或下调。事实上，绘制每个平台上重叠蛋白质的效应大小，显示了效应方向的明显相似性(显著或不显著)，表明生物结果在平台之间是可重复的。图4所示。(A) MBL2 蛋白不同平台间相关性，各自的Spearman相关系数R；(B) 男性和女性的相关图估计35个重叠蛋白的表达比例(log2倍变化)。四个与性别相关的显著表达蛋白用红点标记。结果讨论

        本研究的最终目的是为血浆蛋白质组学现有技术的应用提供一个新的视角。血浆生物标记物的临床需求未得到满足，包括缺乏具有足够的灵敏度和特异性的研究方法，实现检测跨度如此大的动态范围，结果重复性和多重检测性。基于目标蛋白质组学和非目标蛋白质组学的技术都有各自的优缺点，通常需要投入大量资源来优化和提高单一方法的性能。相反，研究人员建议结合两种互补的方法来深入探索血浆蛋白质组，同时保持重复性和灵敏性。

        为了整合非靶向LC - MS/MS血浆谱分析和靶向PEA技术的优势，对173份人血浆样本进行了筛选，比较了两种方法的性能。在蛋白质组的覆盖率和可检测性方面，证明了DDA和DIA模式的MS测量在很大程度上鉴定了相同的蛋白质(276 个蛋白质)。在鉴定蛋白的总数方面，DIA-MS优于DDA-MS，然而，超过25%的样本的蛋白质组覆盖率上，DDA和DIA-MS方法之间差异性不大。在所有样本中，8个Olink panel中超过90%的蛋白质的检测结果高于LOD，表明该分析在一般人群的人血浆中具有良好的检测能力。

 MS和PEA之间的仅35个重叠检测蛋白，表明这些技术侧重蛋白质组的不同部分。通过两两统计比较中分析了35个重叠蛋白的测量重复性。测量数据的分布在不同方法之间具有高度的可重复性，特别是在PEA和DDA-MS之间，其分布的相似性甚至高于MS采集模式之间。根据目前基于MS的血浆蛋白质组分析的发现，主要观察到丰富的功能蛋白，如血清白蛋白、载脂蛋白、免疫球蛋白、急性期蛋白和凝血级联成分。参与炎症和脂质代谢的大量高丰度蛋白质对于心血管和代谢性疾病的分析具有巨大的价值。然而，在深入研究人血浆蛋白质组的低丰度和低分子量组分方面，质谱技术仍有一定的局限性。

        本研究使用的8个Olink PEA技术panel，定量了25种细胞因子，这些低丰度蛋白均未被MS检测到。高通量多重免疫分析低丰度血浆蛋白质组组分测定成为可能。Olink PEA通过双重识别技术克服了抗体交叉反应性问题，最新的PEA技术结合下一代测序读出，可以同时和稳定地定量人血浆中的1463种独特蛋白质，目前甚至无法通过标准的质谱工作流程实现。为了对分析技术进行公平的比较，由于Olink PEA可以快速且基于未加工的粗血浆，选择了可重复的质谱工作流，省略了任何预分离和高丰度血浆蛋白的消耗步骤。

        研究结果表明，可以结合PEA和MS平台的研究结果，以获得更大的蛋白质组覆盖率和更多的生物学见解。PEA技术依赖于抗体，而MS依赖于多肽。在描述血浆蛋白质组方面，两种方法各有优势。将非靶向MS的无偏检测和PEA的高灵敏度相结合，它们互补将带来的前所未有的研究潜力。只有通过多种蛋白质组学技术的互补，各有利弊，才能探索广阔而丰富的血浆蛋白质组学世界。

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参考文献：

Multiplatform Approach for Plasma Proteomics: Complementarity of Olink Proximity Extension Assay Technology to Mass Spectrometry-Based Protein Profiling

J Proteome Res Jan 1;20(1):751-762. doi: 10.1021/acs.jproteome.0c00641. Epub 2020 Nov 30.

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