m6A去甲基化酶ALKBH5通过PRMT6负调节MSC细胞成骨分化|m6A专题

文章题目：m6A去甲基化酶ALKBH5通过PRMT6负调节MSC细胞成骨分化

期刊：Cell Death & Disease

影响因子：8.469

刊登日期：2021年6月

技术手段：m6A测序

最近，秋老虎风头正盛，每天出门都如在蒸笼里行走一般，闷热难耐。小编今天给大伙儿带来一篇清爽的文章，让各位在闷热的天气里也能感受到一丝凉意。接下来，大伙儿就跟着小编的节奏一起来欣赏一下“爽文”吧。

近几年来，m⁶A可谓是科研界的香饽饽，它作为mRNA上最常见的一类RNA修饰，广泛存在于各种哺乳动物、植物、酵母等各类真核生物中。许多研究表明，m⁶A在细胞分化和组织发育中发挥着重要作用，在本文中，作者主要探究了m⁶A去甲基化酶ALKBH5在MSC细胞（MSC）成骨分化过程中的影响。

1. MSC细胞的ALKBH5敲除能够增加小鼠骨量

为了研究ALKBH5在MSC细胞成骨分化过程中的作用，作者构建了Prx1-Cre; Alkbh5^fl/fl实验组小鼠模型和Alkbh5^fl/fl对照组小鼠模型（图A、B、C）。通过μCT分析结果发现（图E），Prx1-Cre; Alkbh5^fl/fl实验组小鼠体内一些与MSC细胞成骨分化有关的指标，如骨体积/组织体积（BV/TV）、骨矿物质密度（BMD）、骨小梁数量（Tb. N）等都有显著增加。随后，作者又进行了HE染色（图F），得到的实验结果与μCT分析结果一致，Prx1-Cre; Alkbh5^fl/fl实验组小鼠的骨小梁数量也有上升。此外，作者还通过免疫组化实验鉴定了骨γ羧基谷氨酸蛋白（Bglap）的表达量，实验结果表明，与对照组相比，Bglap蛋白在实验组小鼠体内有高表达。以上实验结果说明，在小鼠MSC细胞中敲除ALKBH5可以增加小鼠骨量。

2. MSC细胞在成骨分化过程中通过减少ALKBH5的表达来增加m6A的整体水平

接下来，作者想看一下，ALKBH5在人的MSC细胞成骨分化过程中是否也同样发挥作用。作者将人的MSC细胞培养在成骨培养基中14天，通过ALP染色、ALP活性检测和ARS染色的时间梯度实验发现（图A、B），随着时间的增加，ALP染色以及ARS染色形成的沉淀物质有所增加，ALP活性也随之增加，由此说明，体外培养的MSC细胞也有成骨分化的能力。之后，作者又通过dot blot实验和m⁶A RNA甲基化实验检测了m⁶A整体水平的变化，结果表明m⁶A的整体水平以时间依赖型的方式显著增加（图C、D）。

此外，通过WB实验证明ALKBH5的表达量随着成骨培养时间增加而减少（图E、F）。并且，在ALKBH5与ALP活性的相关性实验中，两者为负相关关系（图G）。以上实验结果说明，MSC细胞在成骨分化过程中通过减少ALKBH5的表达来增加m⁶A的整体水平。

3. ALKBH5负调节MSC细胞成骨分化

随后，作者对MSC细胞进行了ALKBH5敲低或过表达处理，通过ALP染色和ARS染色实验，发现敲低ALKBH5（siALKBH5-1、siALKBH5-2组）能够形成更多的沉淀物质（图A、B），而过表达ALKBH5（WT-ALKBH5组）则会呈现与敲低组相反的趋势（图D、E）。此外，I型胶原蛋白免疫荧光实验结果也同样显示，敲低ALKBH5能使I型胶原蛋白表达量增加，过表达ALKBH5则会使其减弱（图C、F）。而后，作者进一步通过WB实验验证了敲低ALKBH5能够增加与成骨分化相关的标记蛋白Runx2、SP7的表达量，过表达ALKBH5可使Runx2、SP7的表达量减少（图G）。以上实验说明ALKBH5负调节MSC细胞成骨分化过程。

4. PRMT6可能是潜在的ALKBH5下游靶基因

作者对sicontrol组和siALKBH5组进行了m⁶A测序。从m⁶A测序结果可知，两组都有m⁶A经典motif序列RRACH富集（图A），m⁶A修饰主要分布在CDS和3’UTR区（图B），并且两组的m⁶A peak 在起始密码子和终止密码子处显著富集（图C）。在敲低ALKBH5后，有790个基因的表达水平发生改变，其中377个基因上调，413个基因下调（图D）。接下来，作者对这些差异基因做了GO富集分析，发现有部分基因与细胞分化、组蛋白甲基化活性等相关。最后，作者通过IGV软件对这些带有m⁶A修饰的基因进行可视化，发现ALKBH5敲低组中的PRMT6基因m⁶A peak丰度与对照组相比有显著的增强，说明PRMT6可能是潜在的ALKBH5下游靶基因。

5. ALKBH5通过m6A修饰下调PRMT6的表达

作者通过m⁶A-qPCR实验，探究ALKBH5敲低后是否会影响PRMT6的表达。实验结果表明，与control组相比，敲低ALKBH5组PRMT6的表达量有显著增加（图A）。而后作者又做了RIP-qPCR实验，发现ALKBH5 IP组PRMT6有大量富集（图B）。接着，作者又用qPCR、WB实验进一步证实了敲低ALKBH5能够增加PRMT6的表达量（图C、D、E）。最后，作者检测了mRNA的降解率，发现敲低ALKBH5后，PRMT6的mRNA降解率显著降低，说明ALKBH5通过影响mRNA的降解率来调控PRMT6的表达（图I）。

6. ALKBH5主要通过调控PRMT6表达来影响MSC细胞成骨分化过程

作者再次通过ALP染色、ARS染色、WB等实验，探究PRMT6在MSC细胞成骨分化过程中发挥的作用。在ALP染色和ARS染色实验中，敲低PRMT6后，生成的沉淀物质显著减少（图A）；WB实验结果显示，在siPRMT6组，Runx2、SP7的表达量也有明显降低（图C、D）。相反，过表达PRMT6，生成的沉淀物质以及Runx2、SP7的表达量都有增加（图E、G、H）。此外，同时敲低ALKBH5和PRMT6能使ALP染色、ARS染色生成的沉淀物质以及WB实验检测到的Runx2、SP7的表达量恢复到对照组水平（图A、C、D）。而与单独过表达ALKBH5组相比，同时过表达ALKBH5和PRMT6可以显著增加沉淀物质的生成量及Runx2、SP7的表达量（图E、G、H）。这些实验结果说明，PRMT6正向调控MSC细胞成骨分化过程，并且，PRMT6在ALKBH5介导的MSC细胞成骨分化中扮演着重要角色。

7. ALKBH5-PRMT6复合物通过 PI3K/AKT信号通路来调节MSC细胞成骨分化过程

之前有研究表明PRMT6可以调节PI3K/AKT信号通路，于是乎，作者就想着探究一下ALKBH5-PRMT6复合物是否通过PI3K/AKT信号通路来影响MSC细胞的成骨分化。通过WB实验可知，敲低ALKBH5能够增强AKT的磷酸化，过表达ALKBH5则有相反的效果（图A）。而敲低PRMT6，AKT的活性会被抑制（图B）。此外，与对照组和单独敲低ALKBH5组相比，同时敲低ALKBH5和PRMT6会降低AKT的活性；与对照组和单独过表达ALKBH5组相比，同时过表达ALKBH5和PRMT6会增强AKT的活性（图C）。随后，作者分别加入PI3K/AKT信号通路的抑制剂和激活剂，来验证PI3K/AKT信号通路在ALKBH5-PRMT6复合物介导的MSC细胞成骨分化过程中的作用。ALP染色、ARS染色实验结果表明，在敲低ALKBH5组中加入抑制剂LY294002会减少沉淀物质的生成（图E、F）。在过表达ALKBH5组中加入激活剂SC79会使由于ALKBH5过表达而被抑制生成的沉淀物质回补到对照组水平（图G），并且，敲除PRMT6后加入SC79也会达到相同效果（图H）。由以上实验可以说明ALKBH5-PRMT6复合物能够通过 PI3K/AKT信号通路来调节MSC细胞成骨分化过程。 

一句话总结全文

ALKBH5通过增加PRMT6 mRNA的降解率，抑制PI3K/AKT信号通路的活性来负调控MSC细胞的成骨分化过程。

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