三分钟了解都有哪些粪菌保存液？ | 微生物专题

与肠道微生物组分析的有关研究在评估人类和动物的健康和疾病方面发挥着越来越大的作用。实验室、临床和现场环境中用于DNA保存的粪便取样方法可能会极大地影响微生物组成和多样性的推断。前期给大家推送了保存粪便的主要方法（一篇文章带你了解保存粪便的常用方法），今天我们主要来讲讲在以往研究中都有哪些保存液被用到？

一．老朋友“乙醇”

乙醇，在实验研究中用到的场景以及次数极其频繁，这是一款最基础的粪菌保存液。乙醇溶液作为一种常用的固定剂，能快速渗入细胞，凝固降解DNA相关的酶，而不损伤DNA，从而达到较好的保存效果。研究探索保存方法对犬粪便微生物群的影响，其中使用三种保存液和不添加缓冲液作对比，发现在没有缓冲液的情况下储存的样品DNA发生了降解，成分和多样性发生了改变^[1]。而用70%乙醇保存粪便与另外三种方法相比较可产生与所有温度下新鲜样本最接近的DNA浓度和细菌组成。Marina Papaiakovou等人研究^[2]认为95%乙醇为现场保存粪便样本提供了最实用的选择。而无水乙醇作为储存剂将粪便标本放置于室温保存，其微生物菌群变化大，不宜选用长期保存样本^[3]。

二、RNAlater

RNAlater是一种水性、无毒的储存试剂，能够抑制细菌生长，无需液氮冷冻粪便样品，可迅速渗透组织，不仅可以稳定和保护未冷冻标本中的细胞RNA，还能防止DNA降解，是有效的粪便防腐剂。RNAlater被用作稳定剂，用于粪便样本在−80°C冷冻储存之前进行保存^[4]。因其适宜在不同储存温度和较长储存期使用的特性，被广泛使用。但RNAlater与其他保存液如70%乙醇相比，DNA浓度显著降低^[1]_。

三、Tris-EDTA缓冲液、eNAT

稳定化培养基对于在没有冷链储存且无法将样品快速运输到冷冻柜或成本高昂的地区进行的微生物组研究至关重要。使用稳定化培养基并在环境温度下储存可以最大限度地减少样品运输或处理过程中与冻融循环相关的DNA降解。

Tris-EDTA缓冲液和70%-99%乙醇历来是微生物组研究中最常用的稳定化培养基^[6]，Tris-EDTA缓冲液用于保存DNA，其原理是溶液中的金属离子破坏DNA，而EDTA可以螯合金属离子来保护DNA。EDTA缓冲液可以在样品保存时抑制某些细菌的生长，但不能以最佳方式保存粪便样本的微生物成分，对基于测序的微生物区系图谱的影响还没有得到很好的表征^[7]。

eNAT是一种商用培养基，用于保存和稳定用于核酸检测的临床标本中的DNA和RNA。这种培养基含有一种蛋白质变性剂(硫氰酸胍)，可以完全灭活微生物，不需要特殊的运输预防措施，它能够在室温下稳定DNA长达4周^[8]。在环境温度下将粪便样本储存在eNAT中30天不会改变微生物组的丰富度、多样性或组成。在无法进行冷链储存的情况下，eNAT是粪便微生物组学研究的有用介质之一。

四．研发试剂盒

OMNIgene.GUT能较好地将人和狗粪便标本保存长达8周^[9]。在评估4°C冷藏、常温储存以及几种常用防腐剂缓冲液的使用情况时发现，除冷藏外，使用OMNIgene.GUT引起的变化最小^[10]。在没有冷藏和冷链运输的情况下，市面上可以买到的OMNIgene.GUT成套设备可能会提供一种重要的替代方案。OMNIgene.GUTDNA稳定试剂盒(DNA Gentek)，是一种可在常温下临时保存样品的商业方法，最近已经面市，但其相对于其他方法的有效性尚未得到独立评估。

NBgene .GUT和OMNIgene.GUT一样可以作为设计用于将微生物储存在粪便中，NBgene. GUT由具有分类成分的洗涤剂组成，用于微生物保存。

五．其他保存液

虽然以往研究中有采用重铬酸钾成功保存粪便样本的实例，且在研究里面发现粪便样品最适合分离肠球菌 DNA 的储存条件是 2.5% 的重铬酸钾。但重铬酸钾的毒性仍然是一个显著缺点，尤其是在保存方案有限的偏远地区使用。当样品需要空运时，重铬酸钾作为航空货运危险品也存在运输问题^[11]。

        一款粪便微生物样品DNA保存液，其中溶解有EDTA、Nacl、DMSO，适用于常温下保存粪便微生物样品、操作简单、适用性较好、可应用于大规模样品检测。其原理是将粪便保存液与粪便样本混合后，可迅速渗入粪便中的微生物体内，使粪便中的微生物处于半溶解状态，停止生长，同时微生物体内的酶被迅速失活，降低 DNA 降解的速率，从而达到粪便样本在常温进行存储的目的。

总结

大量实验结果已经表明，利用保存液保存粪便样品有一个益处，就是可以不同程度的抑制核酸酶的影响，减少DNA的降解^[5]_。使用保存液而不是冷冻粪便收集粪便样本对于肠道宏基因组分析来说是相对可重复和稳定的。因此，保存液在肠道微生物研究中可以毫无问题地使用。粪便样本可以在室温下储存在保存液中，即使储存时间很长。综合我们的所有发现，只要样本放在合适的试管中，并使用合适的溶液，微生物群就可以保持不变。

相关文献

[1] Horng KR, Ganz HH, Eisen JA, Marks SL. Effects of preservation method on canine (Canis lupus familiaris) fecal microbiota. PeerJ. 2018 May 23;6:e4827. doi: 10.7717/peerj.4827. PMID: 29844978; PMCID: PMC5970549.

[2]Papaiakovou M, Pilotte N, Baumer B, Grant J, Asbjornsdottir K, Schaer F, Hu Y, Aroian R, Walson J, Williams SA. A comparative analysis of preservation techniques for the optimal molecular detection of hookworm DNA in a human fecal specimen. PLoS Negl Trop Dis. 2018 Jan 18;12(1):e0006130. doi: 10.1371/journal.pntd.0006130. PMID: 29346412; PMCID: PMC5773002.

[3]Yao Y, Wang F. Effects of different preservation methods on biomacromolecules and microbial flora. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2020 Aug 28;45(8):909-915. English, Chinese. doi: 10.11817/j.issn.1672-7347.2020.190083. PMID: 33053531.

[4]Tap J, Cools-Portier S, Pavan S, Druesne A, Öhman L, Törnblom H, Simren M, Derrien M. Effects of the long-term storage of human fecal microbiota samples collected in RNAlater. Sci Rep. 2019 Jan 24;9(1):601. doi: 10.1038/s41598-018-36953-5. PMID: 30679604; PMCID: PMC6345939.

[5]覃桂师.粪便保存方法对肠道细菌载量的影响[D].华中科技大学,2018.DOI

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[7] Fecal Collection and Stabilization Methods for Improved Fecal DNA Test for Colorectal Cancer in a Screening Setting.

[8]Chomczynski P, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006;1(2):581-5. doi: 10.1038/nprot.2006.83. PMID: 17406285.

[9]Song SJ, Amir A, Metcalf JL, Amato KR, Xu ZZ, Humphrey G, Knight R. Preservation Methods Differ in Fecal Microbiome Stability, Affecting Suitability for Field Studies. mSystems. 2016 May 3;1(3):e00021-16. doi: 10.1128/mSystems.00021-16. PMID: 27822526; PMCID: PMC5069758.

[10]Choo JM, Leong LE, Rogers GB. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Sci Rep. 2015 Nov 17;5:16350. doi: 10.1038/srep16350. PMID: 26572876; PMCID: PMC4648095.

[11]Kuk S, Yazar S, Cetinkaya U. Stool sample storage conditions for the preservation of Giardia intestinalis DNA. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2012 Dec;107(8):965-8. doi: 10.1590/s0074-02762012000800001. PMID: 23295744.

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