实验流程：你的样本在实验室里都经历了什么?—空间转录组专题

看过小编上一期的文章空间转录组样本准备指南后，大家有没有很好奇自己精心修整、包埋好的样本运送到了公司后经历了什么呢？是怎样一步步形成最后漂亮的数据分析图片的呢？下面小编带大家走进实验室一探究竟！

10x Visium空间转录组测序原理

结合显微成像、芯片、测序技术从一片完整的冰冻组织切片中获取切片不同位置细胞中转录组数据，并将组织学和基因表达分析相结合，通过特有软件进行基因表达和形态学数据的可视化。

以联川生物目前已经推出的10x Visium空间转录组测序为例，前期实验准备部分主要分为以下两个方面：

01

组织优化

组织优化芯片：用于确定不同组织的最优透化时间，包含8个捕获区域（8*8mm），每个区域覆盖着mRNA捕获的寡核苷酸且含有readable标签，但oligo序列没有spatial barcode，也不会构建文库。

• 冷冻切片

注：

1. 固定好的片子可以在-80℃密封保存一周

2. 切片出现裂纹或褶皱与很多因素有关：冻头的温度、切片的厚度、切片的速度等。联川生物根据不同的组织类型进行尝试和探索，优化出一系列可调整参数，以获得高质量的冷冻切片

• 组织固定

甲醇的作用：1、有脱水力，可将细胞固定在一定形态并保持细胞活性；2、增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料的吸收作用，吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应

• HE染色

原理：脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷且呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键的方式结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红是一种化学合成的酸性染料，是细胞液的良好染料，它在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞液、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。

注：

玻片取出不及时固定或者室温状态下时间太久均会造成组织表面软化，影响HE染色效果

组织表面不能完全干燥，否则将影响着色效果

• 明场成像和组织透化

注：

在成像时切记设置不加透化剂的阴性对照（Neg）以及不放组织切片，直接加入一定量的RNA的阳性对照（Pos）

02

基因表达

基因表达芯片：用于正式的实验，包含4个捕获区（6.5*6.5mm），包含4个捕获区域，每个区域都有5000个独特的基因表达spots，每个spot直径为55μm（spots之间为100μm），包括spatial barcode。

确定了组织的最佳透化时间后，按照上述方法冷冻切片再次固定在基因表达芯片上，重复上述步骤。

组织透化后样本mRNA与玻片上含有barcode的polyT捕获序列结合，不同的mRNA都标记上了各自的空间信息，针对这些mRNA进行cDNA合成、建库和测序。测序结果既包含基因表达信息也包含每个基因的空间信息。将此结果mapping到HE染色的图片中，可以直观的看到感兴趣的区域内表达了哪些基因、激活了哪些信号通路，可能与周围的区域发生怎样的细胞间通讯等。

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