代谢组学血清、血浆、抗凝剂选择傻傻分不清？看完这篇让你不再迷茫！| 代谢组学
代谢组学作为众多组学的一种，目前已经成为临床研究必不可少的工具，为临床诊断、早期疾病监测、治疗预测和治疗有效率监测开创了一个新的时代。
代谢处于基因调控网络和蛋白质组作用网络的下游，体现着已经发生的生命活动，代谢物的综合分析，则为人类表型提供了一种更直接的特征标签和更敏感的检测方法。
在实际研究中，代谢物易受各种因素影响。生物标本极为复杂的多样性是其中一个主要的挑战，因此，样本的选择、收集、保存等前处理过程是代谢组学一个最基本的关注点。
但许多研究人员在biomarker发现过程中通常主要关注仪器的影响，常常忽略样本相关的变量。
血液样本作为代谢组学中常见样本类型之一，在临床上有很多优势，容易获得且对患者的创伤最小 。
但是临床中对血液样本的操作流程有时并不适合biomarker发现，因为这些样本可能都经过了不同的前处理，甚至有些样本存储于不同的生物样本库，或者分装时间，存储时间及存储条件等方面有轻微差异。以上都可能显著影响代谢物的稳定性。
因此，本文主要对血液相关样本，血清、血浆选择及前处理对代谢组学研究，尤其是在biomarker发现中的影响进行系统的讨论。
1 .血清和血浆的选择
血清和血浆广泛应用于代谢组学研究，但关于哪种样本更适合代谢组学研究仍然存在争论。
血浆是从全血中通过加入抗凝剂和离心分离得到的，而血清是不加抗凝剂通过凝血和离心除去血细胞和纤维蛋白原后分离得到的上清。
整体而言，血清和血浆代谢物种类差异不大，但大多代谢物在两种样本中浓度差异较大。
单位体积全血内分离出的血浆更多，不含血小板和凝结后蛋白片段，然而分离血清中总蛋白含量较低，这可能对小分子分析有更多的好处，特别是过量的蛋白质会导致竞争电离和降低灵敏度。
相比血清，血浆的优点是快速处理，不需要等待血液凝结。凝血时间（30-60 min）以及操作过程中的室温会引入一些变量，且这些变化已被证明影响血清代谢物组分分析。
如：凝集时间可能会增加某些酶和代谢物的降解，促进代谢物的损失；活化的血小板会在凝集过程中释放某些化合物等到血清中，如多肽、次黄嘌呤、黄嘌呤和磷酸鞘氨醇。
相比之下，血浆因为没有血液凝集过程而更适宜进行代谢物分析，结果也更容易重复验证。
血清和血浆均可以用于代谢组学研究，但取样尽量一致，要么都用血浆，要么都用血清。选择血清做样本，一定要严格遵循SOP，在同一研究中，为防止代谢物变化来源于活化的血小板，需要统一所有样本的凝血时间。
血清收集时，建议使用塑料或最好是玻璃的无添加剂收集管。血浆有更好的重复性，但选择血浆时，抗凝血所引起的基质效应也要考虑在内。
表1 血浆和血清的代谢物差异
成分 | 血清 |
蛋白和肽 | 增加：肽 减少：纤维蛋白原 |
氨基酸 | 增加：精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、 丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸 减少：天冬氨酸 |
脂质 | 增加：LPCs、PCs、1-单棕榈酸、2-单油酰甘油、12-羟基十七碳烯酸、12-羟基二十碳四烯酸 减少：溶血磷脂酰肌醇 仅存在于血清中：12-羟基二十碳五烯酸、14-羟基十二碳六烯酸、20-羟基白三烯B4 |
核苷酸 | 增加：次黄嘌呤、黄嘌呤 |
其他 | 增加：3-磷酸甘油、羟基丁酸、核糖、己糖、甘油、花生四烯酸、β-羟基丁酸，2-羟基戊酸，氨基丙二酸，2-氨基丁酸，S-甲基-半胱氨酸，β-d-甲基吡喃葡萄糖苷，肌醇，核糖 减少：丙酮酸盐、柠檬酸盐、甘油酸盐、富马酸盐、尿酸盐、羟胺 |
2. 抗凝剂的选择
抗凝剂的选择也是影响代谢谱质量的重要因素。肝素钠或肝素锂、枸橼酸钠或EDTA盐等是常见的抗凝剂。
肝素是一个抗凝血酶激活剂，而EDTA和柠檬酸盐螯合血液中的钙离子。EDTA不仅抑制血液凝固，也抑制红细胞中依赖Mg2+的酶，使血浆更适合做下游的代谢组学分析。
EDTA和肝素是以固体形式在血液收集管，而枸橼酸钠是液体。使用枸橼酸钠时，通常真空采血管中预配制3.8%枸橼酸钠水溶液，枸橼酸钠抗凝剂与血液比例为1:9。全血中枸橼酸钠浓度比减少会显著影响血小板功能的评估，并增加变异。
有研究显示三种常见抗凝剂（肝素锂，枸橼酸钠， EDTA二钾）在LC-MS分析中代谢产物的结果之间只有微小差异。其他研究还发现使用EDTA和肝素抗凝剂的血浆，具有类似的代谢特征。
关于代谢组学抗凝剂的选择，并没有一个明确的建议选择，但是一旦我们全面考虑了使用的抗凝剂的各种局限性，并且其基本适用于整个研究，那就应该确定下来。
3. 溶血对代谢谱的影响
溶血是最常见的分析前误差，可明显改变血液中的代谢物水平。表现为细胞膜受损后血红蛋白和其他细胞成分包括代谢产物（结构蛋白、脂类、碳水化合物）以及酶的释放。在操作过程中小心操作可以避免溶血。
游离血红蛋白的上限参考值分别为血浆20mg/L和血清50mg/L。当游离血红蛋白浓度在300mg/L（18.8 mmol/L），可看到血清或血浆呈现粉红色至红色。
但在轻微溶血的样本中，这种颜色变化并不明显，因此，最可靠的检测轻微溶血的方法是测定样品中游离血红蛋白。
溶血造成的干扰与样本中的游离血红蛋白浓度近似线性，直接或间接干扰多种检测，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐（Cr）、肌酸激酶（CK）、铁、乳酸脱氢酶（LDH）、脂肪酶、镁、磷、钾、尿素、白蛋白、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、葡萄糖和钠。
研究显示，溶血和清亮血清相比，可引起至少43种代谢物水平明显改变。其中苯丙氨酸、鸟氨酸、乙酸、柠檬酸、甲酸和琥珀酸等在溶血样本中升高，而磷脂酰胆碱和鞘脂等脂类的浓度在溶血样本中下降。
在评估潜在分析前变量的研究中，建议用分光光度法和溶血指数测定样本中的溶血水平。
4. 存储条件
通常对于代谢组样本，优先推荐-80℃冻存，如果临床条件有限，也可暂放-20℃再转移-80℃长期冻存。血浆在-20℃储存超过一个月会造成葡萄糖和脯氨酸等代谢产物的显著变化。
目前，低温长期存储和反复冻融对整个代谢组稳定性的影响仍然是个悬而未决的问题。
尽管近年多项研究显示，-80℃冻存4年以上或反复冻融3次对代谢组的完整性没有明显差异，脂类成分变化也很小，但目前还是建议同一项研究中对所有研究分组样本都最好尽量避免反复冻融，并尽快冻存在-80℃。
5 .样本质量的指标
分离细胞后代谢物的稳定性仍能被血清和血浆残留的酶或者许多其它蛋白所影响。因此，样本处理是影响代谢组稳定性的重要因素。
有研究报道相当数量的代谢物严重受到血清血浆处理过程中分析前变量的影响。
血液处理的时间、血液凝固后到离心的时间、冻融样本后到分析检测之前的时间，都越短越好。另外，吸取血浆时，要小心避免碰触到白膜层，以免吸到血细胞。
对分析前变量敏感的代谢物，包括血清素、次黄嘌呤、牛磺酸、谷氨酰胺和谷氨酸、葡萄糖、乳酸、含硫氨基酸、苏糖酸、麦芽糖、S1P胆固醇代谢物、甘油三酯（TG）、PCS、LPCS和儿茶酚胺类、类花生酸类物质等都具有高度可变性。
因此，如果以这些化合物为候选biomarker时，应该认真评估。
对儿茶酚胺类、类花生酸类物质进行可重复、可靠的分析前，样品预处理是关键的一步，需要在受控的温度下尽快进行。改变血小板代谢和诱导血小板活化的血液处理步骤对于重复分析特定存在于血小板中的5-羟色胺至关重要。
总之，对预分析条件敏感的代谢物必须彻底验证其可靠性，并对结果进行仔细的解释。保持4°C低温下快速处理有助于样本有效保存。
小结
1．首先，血清血浆均可用于代谢组学研究，但取样需尽量一致。整体而言，血清和血浆代谢物种类差异不大，浓度差异较大，具体可根据关注的代谢物做选择。
同时，血浆因无需等待血液凝结，因此重复性更好，如果更注重重复性，可选择血浆做为样本。
2. 对于抗凝剂的选择，三种常见抗凝剂的代谢特征只有微小差异，因此，选择其中某种抗凝剂均可，但是一旦选定适合我们研究的抗凝剂，建议就不要随意更换（注：使用肝素的血液样本，可以用于代谢组学，但是不能用于转录组相关研究）。
3. 对于样本储存，研究显示-80℃冻存4年以上或反复冻融3次对代谢组的完整性没有明显差异，但是仍建议尽快冻存在-80℃并尽量避免反复冻融。
无论如何，对于代谢组学，整个样本预处理过程时间越短越好，需要有一定的SOP，从而保证结果的质量和可靠性。
同时，建议实验过程中对所有样本收集尽可能全的信息，包括采集过程、存储以及临床病例信息，对于解释非预期或非常规出现的结果将非常有用。
参考文献
[1] HernandesVV, Barbas C, Dudzik D. A review of blood sample handling and pre-processing for metabolomics studies. Electrophoresis. 2017 Sep;38(18):2232-2241.
[2] Denery, J. R., Nunes, A. A., Dickerson, T. J., Anal. Chem. 2011, 83(3), 1040–1047.
[3] Denihan, N. M,, Walsh, B. H., Reinke, S. N., Sykes, B. D., Mandal, R., Wishart, D. S.,
Broadhurst, D. I., Boylan, G. B., Murray, D. M., Clin. Biochem. 2015, 48(7-8), 534–537.
相关阅读
点击下方图片进入云平台资料汇总：
所见即所得，绘图高规格
联川云平台，让科研更自由