基于核酸蛋白质定量检测方法|蛋白质组学

基于质谱的蛋白质检测技术为检测大量样本中的蛋白提供了技术支撑；蛋白质检出的灵敏度在疾病的早期的检测、治疗和监测有着非常高的要求。

对特定蛋白识别灵敏度是质谱检测蛋白的缺点，免疫检测法正好可以弥补这个缺点，无论是过去还是现在免疫检测法在疾病的确定和传染病的治疗都发挥重要作用。

在20世纪60年代建立的免疫分析法其灵敏度比较高；对量化的治疗有着非比寻常的意义，已经成为了分子和微生物诊断的工具，如酶联免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）。

ELISA是通过抗体与同源抗原反应检测样品目标分子最常用的技术；传统的免疫检测大部分是基于小分子酶的底物作为信号的检测物质。

而近年研究发现大分子的底物的使用，特别是核酸的使用激发起工作研究者和商业公司的开发热情，因为他们具有更高的敏感性和特异性；并且DNA的独特性质，包括其易于合成、修改和操纵逐渐的成为高灵敏度新的代名词，指数级的核酸扩增的巨大灵敏度也对检测提供的新的出路。

接下来我们主要和大家总结基于核酸高灵敏度的方法，包括如免疫聚合酶链式反应（Immuno-polymerase chain reaction, IPCR）、免疫滚环扩增反应（Immuno-rolling circle amplification, IRCA）邻位连接技术（Proximity Ligation Assay, PLA）等。

2005年 酶免疫测定(EIA) /酶联免疫吸附试验(ELISA)总结

基于DNA的免疫分析法具有更高的灵敏度

一、免疫聚合酶链式反应

（Immuno-polymerase chain reaction, IPCR）

1992年Sano等人首次在免疫分析中引入DNA作为可扩增的标签，目的是将PCR的检测范围扩大到蛋白检测的灵敏度。

免疫PCR（IPCR）是一种结合了ELISA的多功能性及PCR扩增及灵敏的方法，它通过嵌合体匹配特定的抗体及DNA，并通过PCR产生扩增信号。

如图所示：主流的免疫IPCR形式；(a)利用IPCR进行夹层形式检测，一种吸附在微孔上的抗体和一种与DNA标签相连的二种抗体。(b)直接检测的IPCR。

抗原被吸附到微孔上，并用与DNA标记结合的抗体进行检测。加入核苷酸、特异性引物和聚合酶，通过PCR扩增标记物产生信号。

PCR扩增产物的数量与抗原的初始数量成正比，以信号的强度作为蛋白定量的依据。

Sano等人利用该方法检测限降低到了fm，比传统的ELISA敏感度增加了105倍，DNA与抗体的结合、PCR产物定量是两个关键的步骤。

传统的亲和素-生物素反应虽然和共价结合虽然通用性比较好，但是抗体由于存在空间效应会导致亲和力下降。

因此研究人员通过设计IgG结合蛋白将DNA与抗体连接的方式，降低了抗体亲和力的影响，而传统的PCR定量的复杂性影响了IPCR的应用，使用传统PCR方法进行IPCR检测耗时较长，并且需要对产物进行凝胶分离，且不能定量。实时荧光定量PCR的引入，提高IPCR的效率，增加其使用的拓展性。

二、免疫RCA

（Immuno-rolling circle amplification，IRCA）

RCA法又称为滚环扩增技术，主要是通过自然界环状的病原生物DNA分子的复制的方式实现扩增的。

通过将普通的RCA技术与抗原抗体免疫结合就是IRCA法；该方法识别靶向分子的抗体上结合了一段可以与环状模板互补配对的寡核苷酸引物，再通过解旋酶的作用下，扩增出一条和多段环状互补的重复序列构成单链DNA。

如图所示：

(a)免疫滚圈放大(IRCA)原理图，分析物被一抗捕获到固体表面上。捕获的分析物随后被附在寡核苷酸引物上的二抗被识别。

在环状DNA和DNA聚合酶存在的情况下，寡核苷酸引物被RCA扩展，产生一个更长的DNA分子，包含环状DNA序列的多次重复。

(b) ELISA的IRCA和常规免疫分析(ELISA)的比较，IRCA利用共价连接到抗人免疫球蛋白E (IgE)抗体的寡核苷酸引物，实现对人IgE的检测限为0.1 ng/mL，灵敏度比常规提高了2-3个数量级。

IRCA通常具有较宽的动态范围和较好的重现性。IRCA分析优于IPCR分析，因为RCA反应不需要热循环。

RCA反应是在恒定和适中的温度下进行的，因此在RCA扩增过程中抗原抗体复合物没有游离，反应产物仍然局限于抗体抗原复合物，RCA的产物是固定在抗体-抗原符合物上的，这些特性使IRCA在蛋白质微阵列应用更有优势，也非常适合于多蛋白分析。

B. Schweitze等人也证明IRCA微阵列上75种细胞因子的分析具有更高的准确性。

当然，这种方法的缺点在于必须使用专门设计的环状DNA模板，以及引物的伸长是以线性方式发生的，这远远不如PCR中指数级的扩增效率。

三、邻位连接技术

（Proximity Ligation Assay, PLA）

邻位连接技术被认为是IPCR的一种衍生技术，在该方法中，主要是通过协调和近端结合靶蛋白的两个寡核苷酸，通过目标蛋白与两个DNA对应的配体的近端结合，而配体上有特异结合的探针，当有两个及以上的分子同时识别一个靶蛋白时，连接在上面的DNA就会相互靠近，此时加入一段与DNA分子末端互补的序列以及连接酶，就可以作为PCR反应的模板进行扩增，结合探针产生的amplifiable DNA序列就可以侧面反映蛋白的定性和定量。

如图所示：

(a)靶蛋白被两个邻近探针结合，这些寡核苷酸被带到邻近的位置，

(b)一个连接寡核苷酸可以与这两个寡核苷酸杂交，形成一个连接模板。

(c)现在只有新生成的DNA分子可以被PCR扩增和读取。

Ulf Landegren团队通过PLA技术对PDGF-BB的检测来更清晰阐述技术的原理和细节

1）PDGF-BB 是血小板衍生生长因子B的同源二聚体(PDGF-BB)是一种具有促进生长和分化作用的细胞因子

2)接下来需要寻找与PDGF-BB可以进行结合的配体，并可以进行后续的实验研究，文献报道有一个与PDGF-BB有亲和关系的DNA配体在5 '或3 '端有额外的序列元件扩展，形成一个邻近探针对。

3）当一对探针结合PDGF-BB时，其序列延伸的自由端被足够靠近，与随后添加的连接器寡核苷酸杂交，允许末端被酶连接DNA连接，这样被检测的蛋白质分子通过将邻近探针对的自由端结合在一起来促进连接反应，连接产物可以通过PCR进行核酸扩增，而未反应的探针保持沉默。

4）那么我们看下示意图就更加容易理解

1.同源二聚体PDGF-BB的示意图由两个基于aptmer的邻近探针A1和A2结合黑色左侧为A1特异性核酸适配体41t的序列

2.蓝色(A1)和红色(A2)为杂交后连接到普通接头核苷酸的序列延伸

3.黑色框框为PCR引物位点，绿色显示通过5 ' 核酸酶检测实时检测PCR产物的探针

以上是总结基于核酸蛋白质定量检测常用的方法，PEA的技术就是基于PLA技术优化而来，在血浆蛋白质组检测有着非常广泛的应用场景，我们在PEA的前世今生中已经详细讲到。 

对于核酸检测蛋白的方法还有很多方法，比如其他酶介导的高灵敏的蛋白检测，由T7 RNA聚合酶介导的免疫检测（Immuno-detection amplified by T7 RNA polymerase, IDAT）中用T7 RNA聚合酶替代了DNA聚合酶。

非酶介导的高灵敏度的蛋白检测方法：如杂交链式反应（HCR）、DNA自组装等；纳米材料的生物条形码技术（Bio-barcode assay）在许多靶标检测和细胞检测中也具有很优势的前景。

基于核酸的蛋白质高灵敏度的应用虽然非常广泛，但是还是存在一些挑战，如何高效的筛选亲和力和特异性强的适配体是面临最大的挑战，随着蛋白质组学技术的更新，相信未来技术的优化以及结合强大的信息生物学技术，定会为基础科研和临床转化提供研究思路。

声明：文章如有侵权部分，请联系作者删除文章仅用来做技术分享，关于技术保密归属权归原作者、企业或科研单位文章不可用于任何商业用途

参考文献：1.Lequin R M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)[J]. Clin. Chem, 2005, 51(2): 2415-24182.Akter F, Mie M, Kobatake E. DNA-based immunoassays for sensitive detection of protein[J]. Sensors Actuators B Chem,2014, 202(4): 1248-12563.T. Sano, C.L. Smith, C.R. Cantor, Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody–DNA conjugates, Science 258 (1992) 120–1224.E.R. Hendrickson, T.M. Truby, R.D. Joerger, W.R. Majarian, R.C. Ebersole, High sensitivity multianalyte immunoassay using covalent DNA-labeled antibodies and polymerase chain reaction, Nucleic Acids Res. 23 (1995) 522–5295.C.M. Niemeyer, R. Wacker, M. Adler, Combination of DNA-directed immobilization and immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means ofself-assembled DNA–protein conjugates, Nucleic Acids Res. 31 (2003) e906.B. Schweitzer, S. Wiltshire, J. Lambert, S. O’Malley, K. Kukanskis, Z. Zhu, et al.,Immunoassays with rolling circle DNA amplification: a versatile platform for ultrasensitive antigen detection, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (2000)10113–101197.F. Akter, M. Mie, S. Grimm, P.A. Nygren, E. Kobatake, Detection of antigens using a protein–DNA chimera developed by enzymatic covalent bonding with phiXgene A*, Anal. Chem. 84 (2012) 5040–50468.S. Fredriksson, M. Gullberg, J. Jarvius, C. Olsson, K. Pietras, S.M. Gustafsdottir,et al., Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays, Nat.Biotechnol. 20 (2002) 473–4779.Morin I, Dixon N E, Schaeffer P M, Ultrasensitive detection of antibodies using a new Tus-Ter-lock immunoPCR system[J]. MolBiosyst, 2010, 6(7): 1173-1175.10.Morin I, Askin S P, Schaeffer P M.IgG-detection devices for the Tus-Ter-lock immuno-PCR diagnostic platform[J]. Analyst,2011, 136(22): 4815-482110.Chen C, Luo M, Ye T, et al. Sensitive colorimetric detection of protein by gold nanoparticles and rolling circle amplification[J]. Analyst, 2015, 140(13): 4515-4520.11.Yao L Y, Yu X Q, Zhao Y J, et al. An aptamer-based chemiluminescence method for ultrasensitive detection of plateletderived growth factor by cascade amplification combining rolling circle amplification with hydroxylamine-enlarged gold nanoparticles[J]. Anal Methods, 2015, 7(20): 8786-8792.12.Schweitzer B, Roberts S, Grimwade B, et al., Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification[J].Nature Biotechnology, 2002, 20(4): 359-365

作者简介：付俊 联川生物 高级产品经理，谦逊组学服务行业内一股清流，人称付老师。2017年加入联川生物，曾担任联川生物项目经理、生信工程师、转录调控一组组长，近3年多组学服务经验， 2年售前及质谱产品开发经验，服务科研客户均口碑相传。目前负责联川生物质谱线的产品优化和更新，擅长多组学角度进行数据深入挖掘

点击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，绘图高规格

联川云平台，让科研更自由