NC文章用微量m6A测序揭示小鼠抑郁样相关行为 | m6A专题

论文标题：Fat mass and obesity-associated protein regulates RNA methylation associated with depression-like behavior in mice

刊登日期：2021年11月

发表杂志：Nature Communications

影响因子：14.919

研究机构：中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医院基础医学院

01MDD患者和抑郁症小鼠模型海马FTO表达下调

 图1a-p

作者首先对36名抑郁症患者（MDD）和20名健康人外周血进行基因表达谱芯片检测，发现患者组RNA甲基化转移酶（METTL3、METTL14和WTAP）和去甲基化酶（FTO和ALKBH5）均显著下调（图1a），并通过qPCR在验证队列中（50患者VS50健康人）进行了验证（图1b）。

作者进一步测量了慢性不可预测的轻度压力(UCMS)、慢性束缚压力(CRS) 和社交失败压力(SDS)三种常见抑郁症小鼠模型中的m⁶A修饰酶的表达水平，与对照小鼠相比，UCMS小鼠外周血中Fto和Alkbh5的mRNA表达显著下调，而三种甲基化转移酶的表达水平保持不变（图1c）。与对照小鼠海马体相比，所有三种动物模型海马体中的Fto始终下调（图 1f、j、n），而其他酶不变或不一致。WB分析进一步证实，三种小鼠模型海马体中FTO均显著下调（图 1g、k、o）。

同时，与健康对照相比，MDD患者海马组织中FTO表达水平也显著降低（图1p）。

总之，作者发现海马中FTO表达下调可能和抑郁样行为发生有关。 

02FTO介导海马体中的抑郁样行为

 图2a-k 

为测试海马FTO如何导致抑郁样行为，分别特异性敲减（KD）、过表达（OE）、敲除（cKO）小鼠FTO（图2a,b,c）。

分析Fto表达变化的行为后果。与对照小鼠相比，KD小鼠在悬尾试验（TST）中表现出更长的不动持续时间，在蔗糖偏好试验（SPT）中有较低的蔗糖偏好（图2d、e）。cKO小鼠在TST和强迫游泳试验(FST)中表现出更长的不动时间，在新环境进食抑制试验(NSFT)中有更长的进食潜伏期（图 2f、g、h）。表明抑制Fto在海马体中的表达足以诱导小鼠的抑郁样行为。

随后作者探讨了FTO的过表达是否会导致抗抑郁作用。在UCMS模型中，与对照小鼠相比，OE小鼠在TST和SPT中表现出更短的不动持续时间和更多的蔗糖偏好（图2i-k）。表明FTO在海马中的过度表达具有抗抑郁作用。

03FTO修饰海马m6A表观转录组

图3-d 

接下来，作者重点研究了海马Fto介导抑郁样行为的机制。因海马组织较小，作者对海马组织进行了微量m⁶A测序（这篇何川教授作为编辑/审稿人的微量m⁶A测序方法学究竟有哪些玄机? | m⁶A专题）及分析。

结果发现，大多数m⁶A峰优先位于3'UTR和终止密码子周围，并且所有样品中的富集motif都包含‘GGAC’，这是最常见的m⁶A共有motif之一（图3a）。作者分析了不同组之间的差异甲基化peak（DMP）（图3b）。大多数DMP分布在外显子和3'UTR中。

KEGG通路分析表明，Wnt、Ca²⁺、Notch和轴突引导信号通路富集了多个基因簇（图3c）。具体而言，cKO小鼠中的高甲基化基因和OE小鼠中的低甲基化基因都富含神经活性配-受体相互作用途径。

GO分析表明，OE小鼠中具有低甲基化peak的基因主要富集在调节突触组织和信号释放、神经递质分泌和转运以及神经前体细胞增殖的途径中（图3d）。

04ADRB2是海马FTO的靶基因

图4a-r  

作者进一步分析了KD和cKO小鼠中的高甲基化mRNA，以及OE小鼠中的低甲基化mRNA（图4a）。发现KD和cKO小鼠中分别有382和661个基因高甲基化，OE小鼠有613个低甲基化基因，取交集后鉴定了34个共有基因（图4b,c）。

在这34个基因中，Adrb2编码β2-肾上腺素能受体，且已被报道发挥抗抑郁作用。因此作者进一步检查了ADRB2是否有助于海马体中FTO介导的抑郁样行为。

首先证实在KD和cKO小鼠中，抑制Fto表达使Adrb2 mRNA高甲基化，而FTO过表达导致OE小鼠中Adrb2 mRNA 的低甲基化（图 4d，g，j）。在mRNA和蛋白质水平，与对照小鼠相比，Adrb2在KD和cKO小鼠中下调，但在OE小鼠中上调（图 4e、f、h、i、k 和 l）。同时，MDD患者海马区Adrb2 mRNA表达显著低于健康对照（图4m）。

为进一步研究m⁶A甲基化的变化是否影响Neuro-2a细胞中Adrb2 mRNA水平。在存在mRNA转录抑制剂放线菌素D的情况下，Fto敲低加速了Adrb2 mRNA的降解，而FTO过表达显著延迟了这一过程（图4n，o）。当YTHDF2被敲低，Adrb2 mRNA水平显着增加（图4p）。

这些结果表明m⁶A修饰可能影响Adrb2 mRNA水平，至少部分是通过调节其稳定性。

05ADRB2激活逆转海马Fto缺乏引起的抑郁样行为和神经突触损失

图5a-d 

为研究ADRB2是否影响由海马Fto缺陷诱导的表型。用福莫特罗（FOR）激活cKO小鼠中的ADRB2（图5a）。FOR给药在FST和TST实验中缓解了cKO小鼠的抑郁样行为，而用特定ADRB2拮抗剂ICI 118,551 (ICI)预处理阻断了FOR的作用（图5b，c）。

抑郁症已被证明与多个大脑区域的突触功能障碍有关，包括海马体。用FOR连续处理7天的cKO小鼠突触数量显著增加，达到与EGFP小鼠相当的水平，而用ICI预处理阻止了FOR的这些影响（图5d）。

总之，说明了ADRB2激活可以逆转海马Fto缺乏引起的抑郁样行为和神经突触损失。

06ADRB2可能通过c-MYC调节海马SIRT1表达来介导抑郁样行为

 图6a-n 

据报道，SIRT1对海马体突触可塑性至关重要，海马SIRT1信号传导介导抑郁样行为。该研究中，作者发现SIRT1蛋白在cKO小鼠的海马体中下调，但在OE小鼠中上调（图5e）。然而，在所有三个微量m⁶A-seq结果中，没有检测到Sirt1 mRNA的m⁶A水平发生变化，这表明FTO可能通过其他途径调节SIRT1的表达。

研究报道，ADRB2激活通过促进c-MYC的表达上调宫颈癌细胞中SIRT1的表达。且在体外，c-MYC可以与Sirt1启动子结合并诱导Sirt1表达。于是，作者通过ChIP-qPCR分析，发现ADRB2的刺激显著增加了Sirt1启动子结合位点处c-MYC的丰度，而用ICI预处理阻断了FOR对Sirt1启动子结合位点处c-MYC丰度的影响（图5f）。腹腔注射ICI后，阻断ADRB2可显著降低野生型小鼠海马中的SIRT1蛋白水平（图5g）。

在cKO小鼠模型中，FOR处理的小鼠SIRT1表达水平相比盐水处理组明显增加，而用ICI预处理可阻断FOR的作用（图5h）。在OE或cKO小鼠的c-MYC中也观察到类似sirt1表达的结果（图5i）。FOR特定给药到海马体的结果与腹腔给药的结果相似。

在所有三个微量m⁶A-seq结果中，c-Myc mRNA的m⁶A水平也没有变化。与盐水处理的cKO小鼠相比，FOR处理也增加了cKO小鼠中c-MYC的表达，用ICI预处理可阻断FOR的作用（图5h）。野生小鼠中情况一致（图5j）。

与此同时，cKO小鼠海马体中SIRT1的过表达有效地逆转了Fto缺乏引起的抑郁样行为（图5k-n）。

这些观察结果表明，ADRB2调节海马FTO下游以介导抑郁样行为，并且ADRB2可能通过调节c-MYC的表达来靶向 SIRT1。

最后，作者研究了临床实践中最广泛使用的抗抑郁药氟西汀是否可以改善Fto cKO小鼠的抑郁样行为，以及 ADRB2-c-MYC-SIRT1信号通路是否参与了氟西汀的作用。发现氟西汀治疗显著逆转了Fto cKO小鼠的抑郁样表型（图 6a-c）。氟西汀处理的海马中ADRB2、SIRT1和c-MYC的表达水平显著高于盐水处理的cKO小鼠（图 6d、e）。

相关阅读

点击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，绘图高规格

联川云平台，让科研更自由