微量m6A测序揭开卵母细胞和卵泡发育的秘密 | m6A专题

论文标题：METTL3-mediated mRNA N6-methyladenosine is required for oocyte and follicle development in mice

刊登日期：2021年10月

发表杂志：Cell Death & Disease

影响因子：8.469

研究机构：中国农业大学韩建永组、中科院北京基因组研究所杨运桂组等

1.METTL3在卵泡发育中表达，对雌鼠小鼠生育能力至关重要

作者首先通过免疫组化发现METTL3在卵泡形成的各个阶段均有表达，主要位于卵母细胞核和颗粒细胞中。免疫荧光表明，METTL3蛋白位于出生后第5天（PD5）、PD12和GV阶段的卵母细胞核中。在减数分裂的M-II阶段，METTL3信号均匀分散在卵母细胞中。这些结果证明在卵母细胞发育的全过程存在高丰度动态变化的METTL3，说明METTL3可能在卵母细胞的成熟发育、功能调节中发挥了一定的作用。

作者使用Gdf9-Cre技术获得了特异性敲除卵母细胞中METTL3的雌鼠小鼠，通过免疫组化和WB实验证明在METTL3Gdf9cKO小鼠卵巢中的卵母细胞已被特异性敲除METTL3。

作者随机选择了6对6周龄的WT和METTL3Gdf9cKO雌鼠小鼠，将它们与WT雄鼠小鼠共同饲养5个月。六只WT雌鼠小鼠总共生产了232只幼崽，而六只METTL3Gdf9cKO雌鼠没有产生后代。

接着作者们分析了6周、8周和12周时获得的卵巢情况。METTL3Gdf9cKO小鼠与WT小鼠的卵巢大小和体重比在6周时没有显着差异，但在8周时METTL3Gdf9cKO小鼠明显小于WT小鼠。

此外，通过观察不同周龄的雌鼠小鼠卵巢形态，可以发现。METTL3Gdf9cKO小鼠在12周时卵巢表面光滑，几乎没有明显的卵泡结构。

总之，这些结果表明卵母细胞中的METTL3对雌鼠生育能力至关重要。

2.METTL3缺失影响卵母细胞存活能力

为了研究卵泡发育过程中METTL3敲除后的表型，作者对6周龄、8周龄雌鼠的卵巢进行了HE染色，并计算了每个阶段的卵泡数量。在6周龄的雌鼠中，每个阶段的卵泡数量没有显着差异。在8周龄的雌鼠中，与WT卵巢相比，METTL3Gdf9cKO卵巢中有相对较多的初级卵泡以及相对少的原始、次级和窦卵泡。

这表明METTL3主要在生长卵泡发育过程中起作用。

METTL3Gdf9cKO小鼠的卵泡发育缺陷表明，METTL3缺陷的卵母细胞可能会发生细胞凋亡。由于DNA损伤是细胞凋亡的主要诱导因素，作者通过磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)的免疫荧光分析评估了卵母细胞中潜在的DNA损伤。

结果表明，与WT小鼠相比，METTL3Gdf9cKO小鼠的次级卵泡中出现了更多的DNA双链断裂现象。此外，作者还进行了TUNEL染色以验证这一发现。事实上，METTL3Gdf9cKO小鼠在次级和窦状卵泡中显示出明显高于WT小鼠的凋亡信号。

促卵泡激素(FSH)和促黄体生成素(LH)的水平是评估卵巢早衰(POF)的两个重要参数。酶联免疫吸附试验(ELISA)显示，12至20周龄METTL3Gdf9cKO小鼠血清中FSH和LH水平高于WT老鼠。此外，24周龄卵巢中MVH（卵母细胞标记物）的免疫组化表明，METTL3Gdf9cKO卵巢中不存在卵母细胞，这导致卵巢早衰。

这些实验结果说明METTL3对于卵泡发育至关重要，METTL3可以保持卵母细胞的存活。

3.METTL3缺失影响卵母细胞存活能力

作者收集了PMSG作用后6周龄小鼠的GV卵母细胞。实验结果表明，与WT小鼠相比，METTL3Gdf9cKO小鼠的GV卵母细胞数量明显减少，卵母细胞直径也明显变小。

据报道，减数分裂错误会降低卵母细胞的发育能力。因此，作者研究了METTL3敲除对减数分裂的影响，并对微管蛋白进行了免疫荧光染色以检测纺锤体形成。

结果发现来自METTL3Gdf9cKO的大多数卵母细胞不能经历生发囊泡分解(GVBD)，只有少数卵母细胞达到减数分裂I结束，几乎没有发生第一极体排斥，这表明在METTL3Gdf9cKO小鼠中没有产生成熟的MII卵母细胞。这些结果表明METTL3Gdf9中减数分裂的恢复cKO卵母细胞有缺陷，影响了卵母细胞的成熟。

此外，随后检测排卵卵母细胞发育能力的分析结果表明，6周龄的METTL3Gdf9cKO小鼠和WT小鼠之间的排卵数没有显着差异。然而，来自METTL3Gdf9cKO小鼠的大多数卵母细胞无法受精形成受精卵或发育超过四细胞胚胎阶段。

这些结果表明METTL3缺失后，卵母细胞发育能力严重受损。

4.METTL3介导的m6A修饰维持卵母细胞中母体mRNA的稳定性

为了确定由METTL3调控的潜在母体靶mRNA，作者打算先对GV卵母细胞进行了m6A测序做进一步的数据挖掘。由于卵母细胞本身含量极低，所以作者采用了微量m6A测序（low Input m6A-seq）（这篇何川教授作为编辑/审稿人的微量m6A测序方法学究竟有哪些玄机? | m6A专题）。

作者在两个独立的生物学重复中检测到5368个重叠的m6A peak，这些peak对应于3256(45.8%)个母体mRNA，表明m6A在调节卵母细胞母体mRNA的方面比以前何川课题组在斑马鱼中已报道的结果来得更为重要（Nature：YTHDF2介导mRNA降解导致子代斑马鱼发育迟缓 | m6A专题（7））。

与之前的研究结果一致，m6A在GV卵母细胞中检测到的Am6A peak最经典的GGACH motif(H=A/C/U)，并且在编码区(CDS)、3'非翻译区(3'UTR)和终止密码子附近大量富集。90.1%的m6A甲基化的整条mRNA均少于四个peak，但是每个mRNA平均有两个peak。

为了进一步研究METTL3缺陷对母体mRNA丰度的影响，作者基于RNA-seq数据比较了GV阶段WT和METTL3Gdf9 cKO卵母细胞之间的转录组差异。作者发现在METTL3敲除后，具有m6A peak的母体mRNA的丰度比没有m6A peak的母体mRNA的丰度显着降低，表明具有m6A修饰的母体mRNA在GV中优先稳定阶段。此外，GO功能富集分析表明，m6A修饰的母体mRNA优先参与细胞周期、卵母细胞减数分裂和RNA降解的调节。

与微量m6A测序数据一致，RNA-seq数据显示2053个母体转录本在METTL3敲除后显着下调，大约是上调的两倍。GO功能富集分析表明，卵母细胞特异性敲除METTL3总体上降低了细胞周期、卵母细胞成熟和减数分裂相关母体mRNA的丰度。此外，作者鉴定了1098(53.5%)个具有m6A修饰的下调母体mRNA，显着超过342(35.2%)个上调的mRNA。具有m6A修饰的下调母体mRNA也显着富集了卵泡发育和卵母细胞减数分裂相关的生物过程，包括细胞周期和DNA修复。

这些结果表明METTL3，可以通过稳定GV阶段的功能性母体mRNA来维持卵母细胞的发育。

IGF2BP蛋白家族分别包括了IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3，这3个蛋白已被鉴定为属于m6A阅读蛋白家族，可调节mRNA的稳定性。由于GV期卵母细胞中m6A标记的母体mRNA在METTL3耗竭时优先下调，作者假设GV期卵母细胞中母体mRNA丰度的变化可能受IGF2BP家族调节。

因此，作者接下来研究了一些IGF2BP家族可以直接靶向m6A修饰的母体mRNA。

在GV期卵母细胞中仅检测到Igf2bp2和Igf2bp3的表达，表明Igf2bp2和Igf2bp3可能是该阶段母体mRNA丰度维持的主要参与者。为了探索GV期卵母细胞中IGF2BP2/3和m6A之间的相关性，作者使用了已发表文献中上传公共数据库的eCLIP数据进行分析后发现，617(56.2%)个下调的m6A修饰的母体mRNA，被IGF2BP2或IGF2BP3靶向。其中有一组mRNA负责卵母细胞减数分裂和DNA修复。

这些数据表明IGF2BP家族蛋白，尤其是IGF2BP3，作为m6A阅读蛋白可能会参与RNA稳定性，并靶向参与减数分裂和卵子的DNA修复的相关母体mRNA。

5.METTL3通过调节Itsn2的m6A修饰参与卵母细胞成熟

为了阐明METTL3在卵母细胞发育中的分子机制，作者将在GV阶段与METTL3丰度呈正相关的转录本与包含m6A peak并在METTL3缺失时下调的617个IGF2BP2/3结合靶RNA进行了比较。作者发现五个卵母细胞减数分裂相关转录本（Itsn2、Spire1、Myt1、Pias1和Cdc42bpa）和五个DNA修复相关转录本（Brca1、Ercc6l、Palb2、Brca2和Mcm9）可能通过METTL3介导m6A修饰，接下来再由IGF2BP2/3进行RNA稳定性等调节。在这些潜在的靶基因中，作者发现斑马鱼的IGF2BP3-RIP-seq也靶向了ITSN2、Spire1、Pias1、Ercc6l和Brca2的同源基因，这表明IGF2BP3可以在不同物种的不同发育阶段调节这些母体mRNA的命运。

如前所述，Itsn2基因编码一种参与微管形成和信号转导的衔接蛋白，并参与卵母细胞成熟过程中的减数分裂。此外，作者发现ITSN2的丰度在GV阶段与METTL3呈显着正相关。接下来，进行qRT-PCR，结果证实了GV阶段METTL3缺失后Itsn2 mRNA的显着下调。WT卵母细胞相比，Itsn2在METTL3Gdf9 cKO生长的卵母细胞中的mRNA半衰期缩短，表明m6A修饰可能促进Itsn2 mRNA的稳定性。

此外，之前的已发表的m6A测序数据和公开的IGF2BP3-RIP-seq数据显示，Itsn2转录本CDS中只有一个mettl3介导的m6A peak可能被IGF2BP3识别，表明IGF2BP3是维持Itsn2稳定性的潜在辅助因子。

此外，免疫荧光结果显示ITSN2在GV卵母细胞的细胞核和细胞质中表达。然后，作者筛选了三对Itsn2候选siRNA在卵母细胞中敲除Itsn2，并选择了最有效的 siRNA-1进行后续的功能验证。注射siRNA-1敲除Itsn2后，作者发现极体排异率显著降低，一些异常卵母细胞出现较大的极体或对称分裂。

总结

在WT小鼠卵母细胞中，IGF2BP3可以识别带有m6A修饰的Itsn2 mRNA以进一步增强其稳定性并促进卵母细胞减数分裂成熟。然而，在METTL3Gdf9 cKO小鼠卵母细胞中，没有m6A修饰的ITSN2 mRNA在失去IGF2BP3保护后可能会被降解，导致卵母细胞减数分裂成熟失败。

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