银杏叶片发育期内生菌群落研究 | 微生物专题

发表时间：2021.10.4

发表期刊：Front. Microbiol.（IF 5.640）

研究背景：

内生菌是一类与寄主植物建立互惠互利关系的内生细菌和真菌，在植物抗病、农业生产等方面具有重要的应用价值。植物次生代谢物可以介导宿主和内生菌之间的相互作用。本研究采用高通量基因测序技术分析了5个不同采样时间银杏（Ginkgo biloba）叶片中细菌的组成和丰度，以及黄酮类化合物对内生菌群落的影响。

研究对象：银杏叶片内生菌

研究方法：16S rRNA基因测序

研究设计：

选择三棵野生银杏树（即S1、S2和S3），从4月至8月银杏叶子开始生长时，每月收集叶子样本。将每棵树的树冠分为3个部分，从离地5 ~ 7 m处采集200 g健康叶片作为每个部分的样本。总共在5个时间点（T1：4月1日，T2：5月1日，T3：6月1日，T4：7月1日，T5：8月1日）从3棵树上采集了45份叶片样本。将样本运到实验室后，每个样本被分成三部分进行植物化学分析、内生菌分离和DNA提取。用于DNA提取的部分需要进行表面灭菌，并在液氮中冷冻，然后在-80°C下储存。采用16S测序对银杏叶片内生细菌进行分析，并讨论黄酮等化合物对内生菌群落的影响。主要结果：

1. 银杏叶片发育期的植物化学特征

本研究采用高效液相色谱法测定了银杏叶中总黄酮、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的含量，结果表明，这四种物质从T1期到T5期的变化趋势基本一致（图1）。

图1 高效液相色谱法测定银杏叶提取物中黄酮含量（A.总黄酮含量，B.槲皮素含量，C.山奈酚含量，D.异鼠李素含量）

银杏叶片的植物化学分析结果表明，叶绿素A和叶绿素B含量在5月先下降，6月达到最大值，7月和8月逐渐下降，与类黄酮含量的变化相似如图2所示。丙二醛（MDA）含量在T2期先升高后下降，在T2阶段含量最高。超氧化物歧化酶（SOD）活性呈上升趋势，T4期达最大值，T5期略有下降（图2）。

图2 银杏叶子的植物化学分析：A.叶绿素A含量，B.叶绿素B含量，C.MDA含量，以及D.SOD活性。

2. 银杏叶片内生细菌多样性及群落组成

基于16S rRNA基因数据进行内生菌分析，alpha多样性指数结果显示，叶片内生菌群落的Shannon指数和Pielou均匀度在T1期稍低，T2 - T5期保持相对稳定水平（图3）。NMDS分析表明，叶片细菌群落是动态的、时变的（图4）。同一时间点的叶片重复样本聚类良好。Bray-Curtis 矩阵的 ANOSIM 测试还表明，T1-T5 组之间的内生菌群落存在显著差异。最值得注意的是，T1期的内生菌群落在第一轴上与其他四个类群完全分离，其他四个阶段的内生菌群落随着第二轴的变化而逐渐变化。银杏叶内生细菌群落主要由变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、绿曲菌门、蓝藻门和拟杆菌门组成。主要菌属为不动杆菌属、芽孢杆菌属、丙酸杆菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属。不同时期的菌群组成变化分析表明，内生细菌群落组成的变化伴随着叶片的发育。

 图3 内生细菌群落多样性指数

 图4 NMDS显示不同发育阶段银杏叶片内生细菌群落组成和β多样性的变化

3. 银杏叶植物化学参数与内生细菌丰度之间的联系

采用Spearman相关性检验和RDA分析内生菌种群与黄酮类化合物及理化参数的关系。放线菌门与三种黄酮醇苷呈显著负相关，而蓝藻门和绿曲菌门与三种黄酮醇苷呈显著正相关。去除所有相关变量后的 RDA 和 VPA 图如图 5 所示。其中，叶绿素B、总黄酮和异鼠李素因 VIF > 10而被去除。RDA的结果表明，7个选定的理化变量中有 6 个与微生物群落结构显著相关。VPA结果表明，这7个变量对群落总分布的贡献率为49.12%。

 图5 RDA（A）和VPA（B）分析银杏叶片内生细菌群落与环境变量之间的关系

4. 银杏叶片内生菌的分离及其对黄酮类化合物的抗性

从银杏叶片中共分离到11株内生细菌，包括微杆菌属、奇异球菌属、类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、无色杆菌属、伯克霍尔德氏菌属和马赛菌属。其中，只有奇异球菌属和葡萄球菌属与三种黄酮醇苷中的至少一种显著相关。作者监测了选定的内生菌株在添加黄酮的R2A培养基中的生长情况（图6）。培养18 h后，奇异球菌属和葡萄球菌属进入生长稳定期。

 图6 奇异球菌属（A）和葡萄球菌属（B）在添加黄酮的R2A培养基中的生长情况

5. 基于Tax4Fun2预测功能基因

通过基因功能分析，在银杏内生菌群落中注释出7个I级直系类群。在5个样本组中，这些直系类群的相对丰度趋于相似。这些功能基因大部分是新陈代谢基因，占所有基因的近75%。在II级水平，氨基酸代谢、脂类代谢、萜类和多酮代谢、信号转导等4个功能基因的相对丰度在T2期达到最高，然后逐渐下降直到T5。然而，信号转导的相对丰度呈现出几乎相反的趋势。在III级水平进一步分析表明，聚酮化合物的相关基因在T2阶段达到最高丰度，然后从T2阶段到T5阶段逐渐降低（图7）。

 图7 基于Tax4Fun2分析功能基因

主要结论：
本研究首次揭示了银杏叶片不同生长阶段的细菌群落。银杏叶在不同生长阶段和黄酮类化合物的影响下，不同时期的细菌群落有显著差异。Spearman相关分析表明，内生细菌与黄酮类化合物之间存在较强的相关性。体外培养实验进一步为黄酮类化合物对微生物的影响提供了证据。Tax4Fun2的预测结果表明，黄酮类化合物可能影响银杏叶片不同生长期细菌群落的变化。

参考文献：

Deng Y, et al. Endophytic Bacterial Communities of Ginkgo biloba Leaves During Leaf Developmental Period. Front Microbiol. 2021 Oct 4;12:698703. doi: 10.3389/fmicb.2021.698703. PMID: 34671323; PMCID: PMC8521191.

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