如何设计病原菌与植物内生菌的相互作用的实验 | 微生物专题

发表时间：2021.10.15发表期刊：Front. Microbiol.（IF 5.640）背景：由尖孢镰刀菌引起的番茄枯萎病对农业生产的威胁日益增加，不合理的施肥和农药滥用对环境也有一定的挑战。植物病害与植物病原体种群密度、病原体和宿主的遗传类型以及宿主相关的微生物群都具有密切的联系。本研究采用温室实验、高通量测序、人工选择（两种或两种以上）物种共培养等综合方法，研究农业实践、病原体入侵与内生菌群落的相关性和构建抑制内生细菌群落。研究对象：根茎内生细菌研究方法：16S rRNA基因测序研究设计：分别采集不同温室不同生长周期的健康和患病番茄植株的地上茎和地下根（共60例样本）进行16S rRNA基因测序测定其内生菌群组成，并通过qPCR对其根际土壤的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)的foc基因的拷贝数测定病原菌密度以筛选病原菌密度变化与疾病发展过程中起到关键做作用的物种。1. 田间试验过程中土壤理化性质的改变
通过测定苗期(T1)和结果期（T4）土壤的理化性质PH（图1A）、总氮图1B）、氨含量图1C）和有机质含量图1D）发现，有机温室（ORG）的土壤中总氮练个号有机质明显高于传统温室（CON）（p < 0.05, ANOV A）。

图1 两种不同温室的土壤理性性质测定

2. 田间试验过程中疾病的发展和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）密度动态变化
通过测定所有番茄的根际土壤中的foc基因的拷贝数发现，均可以检测到病原菌的存在，其foc基因拷贝数在10^1.45~ 10^9.23。同时也发现7-9月份，疾病发生率在有机温室（ORG）中大约咋31.2%，而在传统温室中达到了49.8%（p < 0.05, ANOVA）。

 图2 7~9月份两种不同温室的发病率

此外，在两种温室中患病的番茄的根际土壤中均检测到了高密度的病原菌。在患病番茄的根际土中病原菌密度大致在10⁸拷贝/克，而健康番茄的根际土中病原菌大约在10²拷贝/克。

表1 苗期至收获期根际尖孢镰刀菌病原体密度动态

注：TIOH:在ORG中起初健康的植株；T4OH：在ORG中健康的植株；T4OI：在ORG中患病的植株；TICH：起初健康的植株；T3CH：始终健康的植株；T3CI：在CON中最终患病的植株。3. 健康番茄的内生菌具有独特的结构
从属水平的物种组成看，与健康植株相比，患病植株的属水平物种Bacillus, Cronbacter, 和Weeksellaceae的相对丰度明显降低，而在有机温室(ORG)中Sphingobacterium, Flavobacterium, Burkholderiaceae和Xanthobacteraceae的丰度有明显的增加。这种趋势同样发生在传统温室（CON）中，此外，Bacillus sp.在苗期具有较高的相对丰度而在患病的番茄植株中丰度较低(图3A和3B）。但是其丰度在健康植株的作物后期阶段优势比较低的（图3C）。

图3 田间试验过程中内生微生物群落组成和多样性的变化

从shannon指数的分析结果看，不管是有机温室（ORG,图4C）还是传统温室（CON,图4D），患病植株的物种多样性相对于健康植株都有明显的下降（p < 0.05, ANOVA）

图4 不同情况下植株的内生细菌的多样性分析

4. 病原体的入侵对内生菌组成的影响
从PCoA的分析结果（图4A和4B）看，不管是在有机温室还是在传统温室，病原的入侵对内生菌的组成有较强的影响（R2= 0.229, P = 0.001,PERMANOVA）。通过RDA分析探究门水平物种多样性的变化（图5A），结果显示所有的土壤变量对总方差的解读度高达56.28%，第一轴解释了36.73%的差异，第二轴解释了另外19.55%。其中病原菌对番茄内生菌组成可能是一个关键的因素，以及厚壁菌门与病原菌呈现出正相关性。另外通过相关性热图可以看到总氮和有机质含量与Proteabacteria 和Gemmatimonadetes具有正相关性（图5B）。
5. 健康和患病番茄植株间的生物标志物
从LEfSe差异分析结果可以看到（图5C），在苗期Bacillus sp. 显著富集在健康的番茄植株中（LDA > 3.5, FD > 2, p < 0.05），而Sphingobacterium、Flavobacterium、Burkholderiaceae和Xanthobacteraceae明显富集在患病植株中。同时也表明随着植株生长量的增加这种差异明显减少。同时，通过相关性分析可以发现（图5D），不管是在有机温室还是在传统温室，病原菌与Bacillus sp.（芽孢杆菌）呈现负相关。
6. 芽孢杆菌（Bacillus sp.）对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有较高的生物防治效果
微生物网络用于描述不同处理和植物健康状态下微生物群落的共现模式。从图6可以看到，与具有复杂的微生物关联的健康番茄相比，病原体入侵破坏了显著简化的微生物关联。

图6 微生物共线性网络图

7. 芽孢杆菌（Bacillus sp.）对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有较高的生物防治效果
拮抗剂中包括Bacillus Megaterium、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、 Pseudomonas aeruginosa和Pseudomonasputida在内的14中芽孢杆菌和14种假单胞菌是已报道的对 F. oxysporum.有明显拮抗作用的生物防治剂。尤其是Bacillus subtilis 6的抑制面积可以达到2.0 ± 0.26 cm (p < 0.05，见图7A）。Bacillus Megaterium 5(BM5)、 Bacillus subtilis 6（BS6）、Bacillus amyloliquefaciens 24（BA24）、Pseudomonas aeruginosa 142（PA142）和Pseudomonas putida 271（PP271）在温室条件下对 F. oxysporum也有明显的抑制作用，生物防治效果可以达到92.8%（见图7B）。

图7 生物拮抗剂对尖孢镰刀菌的抑制作用

主要结论本研究探讨了田间试验条件下番茄的农业实践（有机温室和传统温室）、作物季节（植物发育时间）和内生细菌群落组成与番茄尖孢镰刀菌入侵的相互作用。研究表明病原体入侵可驱动番茄内生细菌组成的群落动态。苗期植株中的芽孢杆菌对抑制尖孢镰刀菌起到关键作用。无论有机或传统温室，健康番茄比患病番茄具有更高的关联网络。同时，芽孢杆菌和假单胞菌是两种田间条件下尖孢镰刀菌拮抗剂的优势类群。相关阅读
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