植物RNA提取概述：方法、技巧、步骤等
植物生长发育的过程中，RNA在基因表达、调控以及行使功能方面都发挥着重要的作用，因此，在许多生物科学研究中，获得大量高质量的植物RNA是至关重要的。植物RNA的特性决定了提取核酸具有一定的挑战性，在本文中我们将讨论RNA提取可能遇到的问题、RNA的类型、植物RNA提取的主要步骤、如何定量和评价植物RNA的质量以及一些技巧帮助更好地提取植物RNA。
什么是核糖核酸？
RNA的类型
为什么提取植物RNA这么难？
植物RNA的应用
植物RNA的提取方法
植物RNA提取的主要步骤
植物RNA提取关键试剂
如何确定植物RNA提取物的数量和质量
植物 RNA 提取的7个技巧
参考文献
什么是核糖核酸？
RNA是核糖核酸的缩写。RNA对于每个生物体来说都是非常重要的分子。它由四种核糖核苷酸碱基组成，即腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和尿嘧啶（U）。有时RNA也被比喻为一份从模板DNA中获得的拷贝。
RNA是单链分子，含有核糖（而不是DNA中存在的脱氧核糖），核糖含有以OH表示的羟基。这些羟基使RNA更具反应活性，容易水解，导致分子不稳定，更容易发生降解。正因如此，在提取RNA时必须更加小心，才能避免发生降解。
RNA的类型
在植物中，主要有三种类型的 RNA：
信使RNA（mRNA）：转录DNA序列并编码蛋白质或调节产物的分子。
核糖体RNA（rRNA）：这种RNA是核糖体结构的一部分，对所有生物体的蛋白质合成至关重要。rRNA是核糖体内的主要物质，按重量计大约是60%的rRNA和40%的蛋白质。
转移RNA（tRNA）：这种类型的RNA分子将mRNA序列解码为蛋白质。tRNA在翻译（从mRNA分子合成蛋白质的过程）期间在核糖体的特定位点发挥重要作用。
这三种RNA在每种细胞中所占的比例各不相同：mRNA约占总RNA的2.0-2.5%，tRNA约占14%，而绝大多数被rRNA占据（约占80%）。后续会提到这些不同RNA的占比会在评价RNA提取质量方面发挥重要作用。
除了上面列出的RNA，研究人员还在动植物中发现了许多共有的其他类型的RNA，也有一些仅在植物中存在的RNA，例如叶绿体RNA。
为什么提取植物RNA这么难？
植物RNA提取中常见的问题是提取产物的总量少，RNA质量差。植物的细胞中有很多代谢物，如蛋白质、脂质、多糖和次生代谢物等。进行RNA提取时，必须裂解细胞破坏植物膜释放RNA，在裂解步骤中RNA不可避免会与这些代谢物混合。这些代谢物在结构上与核酸相似，会发生共沉淀反应，从而降低了RNA提取的产量和质量。抽提足够的高质量植物RNA的难点就在于将RNA与这些代谢物进行分离。
除了代谢物丰富以外，还有一些特性也会增加植物RNA的提取难度：
1、氧化多酚类次级代谢物（如醌）可以与核酸发生不可逆的结合反应，并成为后续反应的抑制剂或降解RNA；
2、许多植物样品存在一些固有特征，比如含有高水平RNases（会降解RNA）、由于高含水量导致RNA浓度很低，纤维组织（如木质素）难以分解和移除等。
RNA的技术应用
RNA在许多技术发挥着重要的作用，可用于了解基因调控和表达。
在传统应用中，RNA常用于：
逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），
定量RT-PCR反应（RT-qPCR）
互补DNA合成（cDNA）
RNA 印迹技术
对于高级技术，RNA也可用于：
数字PCR技术（DDRT-PCR）
抑制性消减杂交（SSH）文库构建
RNA-Seq（研究在特定条件下存在于生物体中的所有RNA的转录本或集合）
染色质免疫共沉淀
ChIP-Seq
植物RNA的提取方法
目前已经发布了数以千计的植物RNA提取方案。但大多数都基于以下三种方法：
苯酚法：主要用于具有高浓度次生代谢物的植物。苯酚通常与氯仿结合以去除多糖污染物。
Trizol法：Trizol已被用于从特定组织（如拟南芥种子）中提取RNA。Trizol是一种市售试剂，可将苯酚和异硫氰酸胍结合在单一溶液中，以便在快速分离过程中产生高产量的RNA。在这种方法中，trizol与氯仿、异丙醇和乙醇在无RNase的水中混合以去除污染物。
CTAB法：十六烷基三甲基溴化铵或基于CTAB的方法已用于提取具有高多糖、二级产物或高水平RNase的植物样品。CTAB提取缓冲液基本上由2%十六烷基三甲基溴化铵、1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、100mM Tris-HCl、1.4M NaCl和20mM EDTA组成。这种方法首先去除多糖，然后是蛋白质，最后是次级代谢物。该方法还可以添加浓度约为0.5%的十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS是一种去污剂，可与蛋白质形成复合物，有助于在提取过程中去除蛋白质污染物。
植物RNA提取的主要步骤
大多数RNA提取可分为四个步骤：
1、均质化：组织可新鲜或冷冻获取。当没有合适的实验室条件时（如从野外工作中收获），样品会在室温下保存在高盐溶液中（如“RNAlater”），直到在实验室处理。使用新鲜或冷冻组织时，样本准备好后，通常将其放置在研钵中用研杵研磨成细粉（也可以使用带有珠子的均质器）。
2、裂解：组织变成粉末后，加入裂解液。在这种情况下，可以使用苯酚、Trizol或CTAB裂解细胞以释放RNA，这一步骤很容易产生杂质污染。这是因为当细胞膜破裂时，所有细胞内容物会同时释放，这意味着RNA与所有其他细胞成分结合，多糖和多酚等代谢物可以与RNA更紧密地接触。同时，RNA酶也开始发挥作用，增加了RNA降解的风险。有些提取试剂的作用类似于RNA酶抑制剂，可以减少RNA完整度受损的可能。
3、清洗：使用不同的互补试剂去除杂质，例如多糖、蛋白质和次级代谢物等。氯仿和异丙醇等试剂分别用于去除多糖/次级代谢物和蛋白质。此外，可以使用基于过滤柱或基于酶的方法去除污染的基因组DNA。
4、沉淀：纯化和清洗抽提得到的RNA，进一步去除杂质，以便后续使用。70%的乙醇、0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水或无DNase和无RNase的水都可以用来保存提取的RNA。最后，一旦RNA溶解在其中一种试剂中，必须在-80°C条件保存。
植物RNA提取关键试剂
在此，我们从众多提取方案中选择了六种非常重要的试剂/操作方法，希望可以重点关注。
裂解液：用于破坏细胞膜并促使RNA释放。通常是Trizol、苯酚或CTAB缓冲液。
氯仿：用于去除多糖。建议使用氯仿进行两次洗涤以获得更好的结果。
异丙醇：去除蛋白质
乙醇：沉淀。通常RNA在70%乙醇中沉淀。
不含RNase和DNase的水：用于RNA提取的所有步骤，也可以用DEPC处理的水代替。DEPC处理水是通过将一定体积的蒸馏灭菌水与DEPC试剂（0.1%v/v）混合来制备的。
RNase：像RNaseA这样的RNA酶是一种嘧啶特异性酶，可在胞嘧啶和尿嘧啶残基处降解单链RNA。
通常，有关RNA的研究旨在分析mRNA，因为它编码蛋白质行使功能，是研究基因表达和调控的关键。但是，提取RNA时，会得到所有不同类型的RNA混合物。
可以通过计算μgRNA/mg组织来对RNA产物进行定量。然而，RNA定量是根据产物中占比最多的核糖体RNA进行评估的，因此，mRNA是间接地通过凝胶上的rRNA估值计算的。
如何通过估值“间接测量RNA”？
植物中的核糖体由两个亚基组成，较大的亚基称为28SrRNA，较小的亚基称为18SrRNA。当这两个亚基都存在于凝胶上时，表明RNA质量很高。如果RNA降解，其中一条条带可能看起来模糊不清，或者两条条带都不会出现。
NanoDrop分光光度计是一种用于验证获得RNA的浓度和纯度（或质量）的仪器。为了评估提取的RNA的浓度和纯度，研究人员会计算230nm、260nm和280nm处的吸光度比率。
如果RNA是纯的，则260/280比率预计约为2。如果该比率明显较低，则表明存在苯酚、蛋白质或其他在280nm或附近强烈吸收的污染物。一般情况，260/230的比率，预计在2-2.2之间。如果该值相当低，则表明存在杂质（如：碳水化合物、EDTA、异硫氰酸胍和苯酚等）。低于预期的比率可能需要额外的清洗。
bioanalyzer是另一种可以更准确地评估RNA总量和质量的仪器。该系统在微加工芯片上电泳进行RNA样品分离，然后通过激光诱导荧光检测来检测RNA。
bioanalyzer的结果表示为色谱图，其中对应28S和18S核糖体单位的两个突出峰表示纯RNA。此外，RNA完整性指数（RIN）是RNA质量的数字化展示结果。对于高质量的RNA，RIN值一般在7-9之间。
植物RNA提取的7个技巧
（1）把所有东西都放在冰上
为了抑制RNase活性，我们要确保RNA提取过程的每一步以及该过程中使用的所有工具都保持低温。
（2）使用过滤移液器吸头
使用非过滤移液器吸头时，移液器筒的内部可能是污染源，而过滤器吸头可阻止颗粒物污染。
（3）戴手套
赤手是RNases的主要来源。在RNA提取时要始终戴手套并经常更换。
（4）始终使用不含RNase/DNase的水。
可以购买不含RNase/DNase的水，也可以使用DEPC制备的溶液，该溶液的作用是使RNase酶失活，避免RNA降解。
（5）在RNA提取之前做一定的调查
在RNA提取前阅读和搜索有关您的样本提取和特定植物物种的更多信息，这可以帮助您注意瓶颈并避免在提取过程中出错。一些植物物种含有的化学成分（例如多糖或多酚浓度等）可能比其他物种的RNA提取更具挑战性。
（6）边提取边写下所有步骤。
通常我们遵循说明书开始实验，并在过程中进行检查。在此过程中，您也可以进行更改。记录这些变化对于了解和进一步优化实验方案非常重要。当实验室中的其他人需要进行RNA提取时，这些实验记录也将成为他们进行提取实验的有利工具。
（7）其他清洗步骤。
有时根据不同的植物种类可能需要额外的清洁，例如，如果您的样品含有大量多糖，则可以用氯仿清洗；若样品含有大量蛋白质污染物，则可以使用丙醇清洗。
参考文献
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