万万没想到！FFPE样本居然还能做肿瘤微生物组！|微生物专题
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FFPE样本，让人又爱又恨
图1 FFPE样本储存着丰富的临床信息
福尔马林固定石蜡包埋 (Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE) 技术处理的样本可以保存组织的形态学结构，是肿瘤研究领域中疾病诊断和科学研究中非常常见的生物学材料（图1）（点击查看>FFPE样本制备及分析）。
FFPE样本具有几个突出的特征：
1）蕴藏着丰富的疾病相关的生物学信息；
2）可以在常温下长期储存，可进行病例长期追溯；
3）FFPE样本的核酸、蛋白降解严重，通常储存时间越长降解越严重（图2）。
图2 不同FFPE样本中的DNA存在不同程度的降解
因为这些特征，一方面，FFPE样本是非常宝贵的临床资源和科研材料，另一方面，使用FFPE样本进行研究时，又会因为样本降解而受到诸多限制。比如因为核酸降解，FFPE样本只被用来开展少数分子生物学实验，比如外显子组测序（WES），miRNA测序，基因表达谱芯片等。
据估计，这世界上大约有数十亿份组织样本保存在医院或者组织样本库中，其中绝大多数是FFPE样本。这里面蕴含着无限的科学研究的机会，让我们充满憧憬。
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FFPE样本居然能做肿瘤微生物组
2020年《Science》报道了一项里程碑式的研究工作，研究者使用新鲜组织和FFPE样本首次系统地对包括乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，黑色素瘤，骨癌，脑瘤在内的7种癌症类型（共计1526例样本）进行肿瘤微生物组（Tumor Microbiome或称Intratumoral Microbiome）鉴定，结果发现每种类型的肿瘤都有不同的菌群组成，乳腺癌组织内菌群最丰富。进一步分析揭示瘤内细菌具有代谢活性，大部分位于细胞内，在癌细胞和免疫细胞中都存在（图3）[1]。微生物群是肿瘤微环境的组成成员之一。(点击查看> 最近发Cell的肿瘤微生物组，你都了解吗？ )
图3 全面探索7种类型的人类肿瘤微生物组
这不是第一篇分析肿瘤FFPE样本中微生物的文章。Masi等也在《Gut》报道使用FFPE样本分析比较胰腺导管腺癌（PDAC）组织内的微生物群是可行的[2]（图4）。用FFPE样本解锁更多肿瘤类型的微生物组或许是个好的研究方向。
图4 PDAC FFPE样本与对照样本的菌群比较
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5R 16S测序，让检测FFPE样本的肿瘤微生物组难度降一半
尽管已有文献报道肿瘤FFPE样本中的微生物研究工作，但是实际开展FFPE样本中菌群研究工作的老师并不多。一方面，很多老师从来没在FFPE样本上打过微生物的主意，因为没有一个好故事（现在有肿瘤微生物组了）；另一方面，对FFPE样本开展扩增子测序分析组织内的菌群，事实上是存在许多挑战的，比如从FFPE样本中提取出高质量的DNA
（点击查看> FFPE样本制备及分析——样本提取 ），又如提取到的DNA中超高的宿主DNA占比，对极低含量菌群DNA扩增的干扰（点击查看>做肿瘤微生物检测，这些问题需重视! ），更困难的是，不同FFPE样本中DNA降解程度不一样，常用的16S引物（如V3-V4）可能结合不到目标区域，也就无法完成扩增和测序等。
最近出现的升级版16S测序——5R 16S测序，即对16S rRNA基因上的五个区域（V2、V3、V5、V6、V8）进行多重PCR扩增和测序。此方法扩增出的区域覆盖约68%的16S全长序列，约是常规16S测序（如V3-V4）的2.5倍（图5）[1]。
图5 5R 16S扩增16S rRNA基因的5个区域
灰色的R1-R5表示5R 16S扩增的5个区域
与V3V4区扩增策略相比，5R 16S测序非常适合于低生物量的微生物样本检测。不仅如此，由于扩增区域较多的特点，使它能兼容有一定程度降解的样本，比如FFPE样本（图6A）。另外一个显而易见的优势，因为测到的16S序列更长，可以大幅提高细菌物种鉴定的分辨率，鉴定到种的数量显著增加（图6B）。表1是5R 16S测序与常规16S测序的比较。
图6 5R 16S测序与常规16测序比较
6A显示随着DNA长度下降（降解程度变高），仅5R 16S测序仍能保持初始的菌群检出
6B显示5R 16S测序在各个分类学层级特别是种层级能鉴定出远多于常规16S测序的菌群
表1 5R 16S测序与常规16S测序比较
5R 16S测序 | 常规16S测序 | |
适用对象 | 微生物含量低的样本，如肿瘤组织，血液 | 微生物含量高的样本，如粪便、唾液等 |
适用FFPE样本检测 | 推荐 | 不推荐 |
检测可变区数量 | 5个，V2、V3、V5、V6、V8 | 2个，如V3-V4 |
检测16S长度百分比 | 约68% | 约30% |
测序平台及测序长度 | NovaSeq6000 PE250或PE150 | NovaSeq6000 PE250 |
灵敏度 | 更高 | 正常 |
特异性 | 更高 | 正常 |
分析流程 | SMURF+TMB | QIIME2+DADA2 |
种水平鉴定 | 可以 | 不建议 |
是否需要设置空白对照 | 需要且进行测序 | 需要，通常不测序 |
我们已将5R 16S测序技术分析了数千份肿瘤组织样本包括几百份FFPE样本的细菌群，包括头颈癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺肿瘤、宫颈癌等。此外，我们也用5R 16S测序分析了一些非癌组织包括脑组织、鼻部息肉、消化道粘膜、胸腺导管、肺组织、肝组织、皮肤组织等，以及乳汁、血浆、血清、白细胞、子宫内膜拭子等。整体的检测效果令人满意。
同济大学用户刘瑶等使用5R 16S测序证实静脉注射改造后的李斯特菌会出现在肿瘤组织内，它会诱导广泛的Gasdmermin依赖性细胞焦亡，从而逆转免疫抑制性肿瘤微环境并促进全身性的抗肿瘤免疫反应（图7）[3]。
图7 用5R 16S测序分析不同分组小鼠肿瘤组织中的菌群
现在有了好用的研究工具5R 16S测序，马上开始解锁FFPE样本的肿瘤微生物组吧！
最后，关于低生物量的微生物组实验设计指南，请查看>做肿瘤微生物检测，这些实验设计你都知道吗？
看完是不是想了解更多？
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参考文献：
1.Nejman, D. et al. The human tumor microbiome is composed of tumor type-specific intracellular bacteria. Science 368, 973–980 (2020)
2. Masi AC, et al. Endoscopic ultrasound (EUS)-guided fine needle biopsy (FNB) formalin fixed paraffin-embedded (FFPE) pancreatic tissue samples are a potential resource for microbiota analysis. Gut. 2021 May;70(5):999-1001.
3.Liu Y, et al. Intravenous Delivery of Living Listeria monocytogenes Elicits Gasdmermin-Dependent Tumor Pyroptosis and Motivates Anti-Tumor Immune Response. ACS Nano. 2022 Mar 22;16(3):4102-4115.
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