讲座回顾｜FFPE释放新价值：肿瘤组织微生物组研究思路解析
5 月 17 日在线举办的【唤醒沉睡的样本库】系列讲座第三期：FFPE 样本释放新价值已圆满结束。本次讲座中联川生物吴鹏经理与安捷伦诊断与基因组学黄妤经理就“FFPE 样本研究新思路— Microbiome+WES，解锁肿瘤微生物组”，“安捷伦最新人全外显子组 V8”两个讲题进行了精彩分享。
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Q1
肿瘤微生物含量低容易被污染，我们该如何去除污染菌？
做肿瘤微生物需要特别注意，不管是新鲜组织还是 FFPE 样本。首先要尽可能地做到无菌的操作。实际上还是做不到完全无菌，就有必要设置一定量的空白对照样本。如果是用石蜡样本做微生物检测，比较好的空白对照，就是包埋了组织石蜡块，没有包埋到组织的那部分，切一些空白的石蜡片，这是石蜡样本很好的污染菌鉴定的空白对照样本。
总之，我们需要在采样端，实验端都设置一定数量的空白对照，这些空白对照与检测样本一起完成全部的实验，包括测序，最后根据测序后的数据，可以鉴定出污染菌，可以从实验样本中检测出的菌中扣除空白样本中检测出的污染菌。
Q2
5R 16S 测序和我们常用的 16S 测序有什么区别和优势？
常用的 16S 指的是二代测序的 16S。从实验的角度来说，最主要的区别还是扩增的可变区的数量，5R 16S 是扩增五个区域，5R 16S 会比常规的 16S 扩增的更多。带来的好处显而易见：在用序列和数据库进行比对时，序列越长，特异性就越高。5R 16S 在鉴定细菌时，分辨率会比常规 16S 更高。同时因为 5R 16S 的特性，针对有一定程度降解的样本，常规的 16S 可能会无能为力，无法扩增。而 5R 16S 因为扩增五个区域，即使有些降解存在，还是有很大可能把目标序列扩增出来。从我们做过的项目看，大部分的石蜡样本是可以扩增出菌群目标序列的，但也有一些石蜡样本降解过于严重，5R 16S 也是扩增不出来。
Q3
FFPE 样本做微生物检测，有哪些质控步骤？
除了常规质控步骤外，特别要强调一下，FFPE 样本在提取核酸之后，需要对于提取的 DNA 做质检，对 DNA 降解程度有一个了解，有时 DNA 条带已经降解到很小的片段，比如 200 bp 以下，这样的样本就不建议做微生物检测，因为已经难以扩增出目标序列了。
Q4
5R 16S 测序适合检测微生物含量低的样本，那么除了肿瘤微生物，还可以检哪些样本类型？
5R16S 技术并不只适用于肿瘤微生物检测，实际上也适用于其他微生物含量较低的样本检测，我们除了检测组织中的微生物外，也确实做过一些其他类型的样本，非肿瘤类包括正常组织、皮肤样本，以及体液样本，比如血清、血浆中的微生物检测。5R 16S 测序对于低生物量微生物样本检测的表现，整体是令人满意的。
Q5
5R 16S 是用一对引物对 5 个可变区一次检测，还是用几对引物分几次独立检测？
很显然，用一对引物是不可能将五个可变区同时扩增出来的。除非打包在一起扩增，实际上 5R 16S 是采用的多重 PCR 技术，是要用多对引物去做扩增，因为是多重 PCR 所以不是分成几次的独立实验，一次多重 PCR 实验即能同时把 16S 的五个区域扩增出来。
Q1
请问为什么探针长度是 120 nt？
首先要明确为什么选择 RNA 探针，RNA 探针与 DNA 结合强度更强，能够更好捕获 DNA 的靶标；同时，RNA 探针有更好的柔韧性，可以形成高级结构，这样可以捕获一些更为复杂的突变，所以在等位基因的呈现性上比 DNA 探针更好。
我们捕获的目的不是仅捕获与探针一模一样互补配对区域，而是在探针相关的区域发生任何形式突变，也可以捕获到。这时就要兼顾捕获探针的特异性和灵敏度。从长度上来说，捕获探针长度越长，特异性会越好，但这个时候会损失检测的灵敏度。120nt 这个长度是经过非常多的实验验证和测试总结出来，可以兼顾特异性与灵活度的比较理想的长度。
Q2
V8 的设计文件比 V6 和 V7 小，是不是后者的有些内容在 V8 里没有覆盖？
无论不同版本迭代，安捷伦秉持的宗旨是不变的，始终坚持对数据库以及数据库里的基因和外显子实现最全的覆盖。安捷伦的探针在 WES panel 的设计上，是不会因为任何原因放弃这个初衷和宗旨的。V8 相比 V6 design size 显著缩小，根本原因是 V8 探针设计采用机器学设计的方法，这种方法相比于平均覆盖的方式，非常显著地缩小探针的使用数量，同时保证探针覆盖的均一性和捕获效率。在三个版本上，V8 设计理念也不同，V8 更注重不同用户的需求，在核心 V8 外显子的基础上，会设计延伸的版本，比如 V8+NCV, V8+UTR，不同的版本为了满足不同的应用，做了一些差异化。但是以往 V7 或者 V6 没有做这些差异化，另外，V6 还包括 microRNA，V8 核心版没有包括，但 V8 本身设计的灵活性是允许我们添加感兴趣的任何区域。Design size 的缩小核心还是探针设计和铺设方式的优化。
Q3
请问如果在传统 WES 探针基础上增加 mtDNA 以及乙肝、HPV、新冠病毒等病原微生物探针以扩展对线粒体疾病和常见病原体的检测范围。在 suredesign 网站的设计操作上有哪些注意事项或者建议？
之前已经提到 V8 有很大设计的灵活性，比如提到 mtDNA，可以把它理解成一个已经设计好的 sub panel，如果需要 mtDNA，只要在 SureDesign 在线设计软件上把它加到 V8 上 design 上。对于乙肝 HPV，可能没有现成的探针，我们可以在 SureDesign 上添加感兴趣的区域。添加的形式也很多，比如添加基因的名字和基因组区都可以。如果应用相对复杂，欢迎大家和技术支持团队联系，后台技术支持同事会辅助进行一些区域的设计和添加，确保一次到位的把 panel 设计好。
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