用户文章｜宏基因组和代谢组学揭示红霉素对多物种生物膜模型的生态毒理学影响-代谢组学专题
标题：Ecotoxicological effects of erythromycin on a multispecies biofilm model, revealed by metagenomic and metabolomic approaches
发表日期：2021年5月
发表期刊：Environmental Pollution
影响因子：8.071
技术手段：非靶代谢组学，16S rDNA测序，宏基因组
1. 生物膜群落多样性分析
首先，通过16S rRNA基因测序，对生物膜的微生物分类组成进行研究。在生物膜样本中共检测到2053个OTUS，其中512个（24.9%）是红霉素暴露组所特有的，347个（16.9%）和593个（28.9%）是对照组在3周（C3）和6周（C6）时所特有的（图1A）。α多样性分析显示（图1C），无论红霉素暴露（T6 vs C6和C3）或生物膜时间（C3 vs C6），受试组之间没有显著差异。
对门水平上的分类进行分析（图1D），对照组不同时间下（C3 vs C6），放线杆菌门、拟杆菌门和α-变形杆菌门的丰度相对增加，而厚壁菌门、Dependentiae、 γ-变形杆菌和疣微菌门的相对丰度降低。在红霉素暴露下（C3 vs T6），厚壁菌门、Ignavibacteria和疣微菌门的丰度显著增加，而放线菌门、拟杆菌门、α-变形杆菌门和γ-变形杆菌的丰度下降。总体而言，在所有样品中，变形杆菌是变化最大的门。
此外，相对丰度热图分析表明，红霉素暴露的生物膜显示出40个最具代表性的分类群的不同丰度分布（图1F）。疣微菌门丰度显著增加，新鞘脂菌、Hassallia 菌（拟杆菌门）以及严格梭状芽胞杆菌1（厚壁菌门）与含红霉素的环境有关。进一步比较红霉素暴露的生物膜和相同时间的对照生物膜（T6 vs C6），发现前者的巴氏梭菌（厚壁菌门）的丰度降低。
图1生物膜样品的微生物组成
2. 红霉素暴露后淡水生物膜代谢和功能基因的变化
对所有生物膜样本进行宏基因组测序。对不同样本门级别下菌群的代谢通路进行分析（图2）。结果表明，与C3相比，C6的RPM值大部分升高，特别是与氨基酸运输和代谢、信号转导代谢、能量代谢和细胞壁生物发生相关的基因；而在T6组中，除细胞壁/膜/被膜生物发生外，所有RPM值都有下降的趋势。从分类群水平上看，微生物门的丰度在C6组中比C3组有所增加，甚至超过了T6。同时，在C6和T6中，放线杆菌和拟杆菌的丰度显著下降，而绿弯菌门的丰度略有增加。总体而言，β-变形杆菌是所有三个组的优势门，其次是绿弯菌门。
对C6和T6生物膜的差异基因进行分析，722个基因上调，385个基因下调（图3a）。对其中40个显著上调或下调的基因分别聚类（图3b和c），C6组中下调的基因丰度较高，上调的基因T6组一半以上丰度较高。
图2 生物膜不同菌的功能富集
图3 C6和T6组之间的基因丰度和聚类
3. 基因丰度分析显示不同门类及其移位基因的作用
接着，作者评估了三组样本基因丰度，并评估了其不同菌门与一些对生物膜形成和环境胁迫反应至关重要的基因及代谢途径间的关系（图4）。除K05364基因（编码青霉素结合蛋白A）外，疣微菌门与细胞壁伸长有关的基因丰度最高，其中T6组的细胞壁伸长相关基因丰度最高。拟杆菌门、β-变形菌和α-变形菌也表现出相对较高的与细胞壁伸长有关的特定基因的丰度。在生物膜的发育过程中，菌群之间的一些正向关系得到了加强（C3与C6）。例如，在红霉素暴露前，γ-变形菌与疣微菌门和Ignavbacteria呈负相关。在红霉素暴露后，获得了一种更复杂的相互作用模式，其中大多数类群都是正相关的，但也有一些是负相关的，例如，酸杆菌门与拟杆菌门和疣微菌门都是负相关的，而厚壁杆菌门和γ‐变形菌纲也是负相关的（C6 vs T6）。
图4 涉及生物膜形成和胁迫反应的关键代谢通路中的基因和相应菌
4. 非靶向代谢组学数据揭示脂代谢及其相关代谢物的作用
非靶向代谢组学数据揭示脂代谢及其相关代谢物的作用数据处理后。为了获得代谢变化的总体情况，作者将所有代谢物以正/负和MS1模式映射到KEGG中。在MS1水平上，正向和负向模式在代谢通路上表现出一致性，其中大多数被富集到脂质和氨基酸代谢在内的通路，其次是一些其他通路，如多糖生物合成、由信号转导和信号途径组成的环境处理以及其他相关通路（图5）。在MS2水平上，获得的代谢物较少，其中大多数富集在一般代谢通路中，其次是嘌呤代谢以及氨基酸和不饱和酸的生物合成。
值得注意的是，亚油酸代谢被发现在红霉素暴露中起关键作用，因为阳性和阴性模式都显示相应代谢物显著下调（p ≤ 0.01）。其他关键代谢途径包括类固醇生物合成和维生素B8代谢等（图6）。具有显著差异的代谢物大多数都富集在脂质和类脂分子中，其次是有机酸和有机杂环化合物，如赖氨酸和有机杂环化合物，如吡哆醛。
图5 基于MS1注释的候选代谢通路。a：正模式；b：负模式
图6 C6和T6样品的代谢物和显著差异代谢物(p ≤ 0.05)
结论
利用宏基因组测序和代谢组学方法，本研究旨在阐明当红霉素暴露于亚抑制浓度时，多物种生物膜内发生的根本变化。在表型水平上，红霉素暴露后观察到细胞伸长，反映了肽聚糖生物合成的增加。宏基因组测序显示，在红霉素胁迫下，α/β多样性指标没有明显变化，暴露在淡水生物膜中的疣微菌门、拟杆菌门和β-变形菌门的丰度大大增加，这可能有助于维持系统的完整性。
非靶向代谢组学数据显示，脂质在淡水生物膜的调节中起着关键作用，而亚油酸代谢在这一过程中起着基础性的作用。总体而言，本研究对多物种生物膜在暴露于单一环境压力后的反应进行了独特的概述。此外，这项研究论证了使用实验室模拟的多物种生物膜在基本水平上研究它们与特定生物活性化合物或污染物的相互作用和反应性的可行性。
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