PBJ（IF=13）：鹰嘴豆转录组+miRNA+降解组多组学整合分析 | 转录调控专题

论文标题：Integrated transcriptome, small RNA and degradome sequencing approaches provide insights into Ascochyta blight resistance in chickpea

刊登日期：2018年10月

发表杂志：Plant Biotechnology Journal

影响因子：13.263

研究机构：印度半干旱热带国际作物研究所基因组和系统生物学卓越中心 

技术手段：RNA-seq、miRNA-seq、Degradome Sequencing

文章架构：







主要研究内容：

01RNA-seq及差异表达分析

图1 不同基因型组合中差异表达基因（DEGs）

该研究为研究鹰嘴豆抗AB（子囊藻枯萎病）的复杂机制，分别选取了两种易感基因型（C 214和Pd 7）、两个抗性基因型（ICCV 05530和ILC 3279）和一个携带两种AB抗性QTL导入系（BC3F6）。上述基因型幼苗分别在感染AB后第3天和第7天采样测序（对照组和胁迫组），其中样品名BC3F6-C-3d表示具有BC3F6基因型的幼苗在未感染AB条件下第3天采样样品的组别，BC3F6-S-3d表示具有BC3F6基因型的幼苗在感染AB下第3天后采样样品的组别。

结果显示对未感染AB的3天后取样的AB抗性株以及AB易感株进行差异分析得到 284个差异基因（上调183个，下调101个），感染AB后7天取样的易感株系和抗病株进行差异分析后得到2607个差异基因（上调953个，下调1654个）。生信分析发现诸多比较组特异差异基因（图1 d-e），表明鹰嘴豆在AB病应激下存在特异性的基因在特定基因型鹰嘴豆株系表达的情况。

02差异基因富集分析

图2 差异表达基因（DEGs）注释及通路途径分析

GO富集分析显示差异基因主要富集的生物学过程有氧化还原过程、转录调节、真菌防御反应、几丁质反应、水杨酸反应、茉莉酸反应、脱落酸反应，乙烯激活的信号通路和生长素反应；显著富集到的分子功能ATP结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、氧化还原酶活性、过氧化物酶活性、水解酶活性；细胞成分有植物型细胞壁、质外体和膜锚定成分（图2a）。

    差异基因主要富集的KEGG通路有代谢途径、次级代谢产物的生物合成、植物激素信号转导和植物病原体相互作用（图2b）；在对感染条件下所有基因型中10个最丰富的转录因子（TF）的差异表达特异性分析显示，在感染第七天后所有基因型中差异表达的TF编码基因的数量都较高（图2c）。

03在对照和胁迫组中鹰嘴豆基因型的表达聚类分析

图3 差异表达基因（DEGs）表达谱的聚类分析

通过聚类分析确定了不同时间条件下抗性基因型（ILC 3279、ICCV 05530和BC3F6）和易感基因型（C 214和Pb 7）中具有相似表达趋势的基因；DEGs被分成六大类，与对照组相比抗性基因型的上调趋势更显著（图4）。

① Cluster 1表明在感染后第3/7天由抗性基因型诱导表达的基因组成，这些基因参与水杨酸反应、代谢过程、氧化还原过程和类黄酮生物合成过程和对生物刺激的反应；

② ClusterⅡ显示在感染后第3/7天时抗性基因型中的基因表达受到抑制，这些基因主要与生长素反应、分解代谢过程、氧化还原酶活性、血红素结合和木聚糖乙酰化有关；

③ Cluster Ⅲ显示在感染后第3/7天时抗性基因型诱导表达的与病原体识别和防御反应有关的基因；

④ Cluster Ⅳ显示在感染后第3天时表现出抗性基因型显著上调的基因，主要包含与真菌防御反应、几丁质分解代谢过程、信号转导、过氧化物酶活性和氧化还原过程有关的基因，其中抗病基因型与易感基因型相比编码抗病反应蛋白的基因（DRRG49-C）显著上调；另外，在抗性基因型中诱导的应激反应基因（COBRA等）在接种第7天时受到显著抑制；

⑤ Cluster Ⅴ表明在感染第7天时由抗性基因型上调的基因与细胞壁生物发生相关，如纤维素合酶、细胞壁松弛样扩张蛋白和离子稳态；

⑥ Cluster Ⅵ显示在感染第7天时在易感基因型中诱导表达的基因，主要参与防御反应、蛋白质水解、脱落酸反应、水杨酸反应、水解酶活性、茉莉酸和乙烯介导的信号通路、蛋白质磷酸化和叶片衰老；在易感基因型组别中，衰老相关蛋白、加速细胞死亡11、脱水相关蛋白、茉莉酸O-甲基转移酶、果胶酯酶和钙转运ATP酶以及编码NAC、MYB和ERF的TFs等基因上调（图4）；另外，在易感基因型中，该类衰老相关和加速细胞死亡蛋白的大多数基因在感染第3天时受到抑制，在接种第7 天时被诱导表达。

04抗性株和易感株间差异miRNA生信分析

图4 抗性和易感基因型中miRNA的差异表达分析

作者通过miRNA测序鉴定鹰嘴豆中与AB胁迫相关的miRNA，小RNA读取的长度分布表明，24nt小RNA的类别最丰富（51.2%），其高表达表明在所有分析样本中内源性的siRNA丰富表达。使用miRDeep-P工具识别有效的新的miRNA，通过过滤处理miRNA前体二级结构、去除不符合标准条件的miRNA后，获得173个新的miRNA。miRNA的长度为20-24nt，与DCL切割活性的产物一致；另外，评估候选miRNA核苷酸的组成，发现大多数21个核苷酸长的miRNA的特征是50个尿苷残基，这也是DCL1切割和AGO1结合的特征属性。

通过聚类分析，筛选出的miRNA共有240个家族，最大的家族是miR166。另外，鉴定出5个新的miRNA聚类在一起，表明其可能是进化的保守miRNA家族成员。为筛选出对AB应激有作用的miRNA（图4），在所有文库中对鉴定的miRNA进行分析。

结果显示，在不同组别中有297个差异表达的miRNA，大多数miRNA在AB应激条件下下调，大量miRNA以抗性基因型和阶段特异性差异表达；在AB应激条件下约有25%差异表达的miRNA在第3天时具有基因型特异性，而在第7天约有44%的miRNA具有基因型特异性。

在抗性基因型中感染后的第3/7天，3种新的miRNA（nov_miR3a、nov_miR64和nov_miR171）均上调，miR3627b、miR2111l、miR12111-3p、miR1507b、nov_miR123、miR166i-5p和nov_miR81均下调；另外，有一部分miRNA在两种抗性基因型（ILC 3279和ICCV 05530）中表现相似的趋势。

05miRNA靶基因及降解组测序分析

图5 miRNA靶基因本体富集分析

植物miRNA与其相应的靶基因具有互补性。通过降解组测序共获得1.344亿clean reads，共鉴定出2131个靶基因，其中miR396家族成员具有最多的靶基因（148），其次是miR167（106）和miR156（80），它们主要属于TFs、植物激素、应激反应基因、抗病基因（如NBS-LRR）、细胞酶（如激酶、还原酶和磷酸酶）。

通过GO富集分析，主要富集到的生物学过程有RNA修饰、细胞壁生物发生、防御反应、茉莉酸反应、信号转导和水杨酸反应，分子功能有核酸内切酶活性、miRNA结合、氧化还原酶活性和木聚糖O-乙酰转移酶活性，细胞组成成分有核、质膜和线粒体内膜前序列易位酶复合物（图5）。

图6 与子囊藻枯萎病（AB）反应相关的miRNA及其靶基因之间的互作网络

另外，通过KEGG富集分析，富集到的主要通路是与应激反应相关的途径，包括植物-病原体相互作用、植物激素信号转导、次级代谢产物的生物合成和MAPK信号途径；

利用Cytoscape对参与AB应激反应的miRNA和基因构建互作网络，结果显示参与应激反应的基因包括编码PR蛋白、糖基转移酶（GT）、五肽重复蛋白（PPR）和抗病基因，如NBS-LRR等（图6）。

06miRNA表达谱及其靶基因的相关性分析

图7 抗性和易感基因型中鉴定的miRNA及其靶基因的相关网络

作者利用Pearson相关分析对miRNA及其靶基因表达谱进行相关性分析，在感染第3和第7天应激条件下，所有组别中分别鉴定出757和693个miRNA-mRNA相互作用对；在757对中，371对在感染第3天时为正相关，386对为负相关（图7 a），在693对中，357对在感染第7天时为正相关，336为负相关（图7 b）；

图8 miRNA-mRNA表达谱及其关系验证

在正相关的miRNA-mRNA作用对中，作者确定了12对在抗性基因型（包括BC3F6系）和易感基因型中表现出miRNA-mRNA（图8 a）；在所有抗性基因型在感染第3天时miR159k-3p、miR482b-3p和miR156r下调，其靶向的渗透蛋白样蛋白、NBS-LRR和鳞片启动子结合类似蛋白分别上调；相反，在所有抗性基因型中，miR319 l上调，其靶点TCP转录因子下调。在所有抗性基因型在感染第7天时，miR171b、miR5232和miR157a上调，其靶向的ERF基因、钙转运ATP酶和衰老相关蛋白下调（图8 a）。

另外通过降解组验证确定了5对miRNA-mRNA，分别是 miR482b-3p:CC-NBS-LRR、miR167c:Dof锌指蛋白、miR171b:ERF、miR157a:衰老相关蛋白和miR5232:钙转运ATP酶（图8 b-d）。最后通过分子实验定量验证高通量测序与qRT-PCR获得的结果之间具有一致性。

总结

该研究首次尝试整合mRNA和miRNA表达数据以及degradome分析，确定了鹰嘴豆对AB应激的基因型特异性反应，而不是抗性和易感基因型的共同反应，并且明确在两种抗性基因型中（ICCV 05530和ILC 3279）表现出相似表达的基因，但在BC3F6基因型中表达不同。

miRNA-seq和RNA-seq综合分析确定了12对miRNA-mRNA，通过降解组验证确定了5对miRNA-mRNA可以作为培育鹰嘴豆具有AB抗性的候选基因。

 




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