用户文章The Plant Journal | 代谢组和蛋白组揭示紫杉醇在红豆杉中的组织特异性及调控机制

论文标题：Tissue-specific study across the stem of Taxus media identifies a phloem-specific TmMYB3 involved in the transcriptional regulation of paclitaxel biosynthesis

刊登日期：2020年01月

发表杂志：plant journal

影响因子：7.091

研究机构：杭州师范大学

技术手段：代谢组、蛋白组

摘要

红豆杉的茎皮可用于紫杉醇的提取。然而，对于红豆杉茎部的紫杉烷类代谢物的组成以及紫杉醇生物合成酶的茎部结构特异性，我们知之甚少。
作者采用曼地亚红豆杉（taxus media），通过代谢组学和蛋白组学分析了茎的代谢谱和蛋白谱，并研究了TmMYB3在紫杉醇生物合成中的功能。组学研究发现，代谢物在不同的茎部结构的积累量不同。并检测到紫杉醇在韧皮部大量积累。另外，作者发现了和紫杉醇生物合成相关的10种酶，其中多数也是在韧皮部产生。作者分离分析了TmMYB3的全长序列和5个紫杉醇合成相关基因的部分启动子序列。在TS、TBT和DBTNBT三个基因的启动子序列中发现了一些MYB识别元件。更多的体内体外研究表明，TmMYB3通过激活TBT和TS的表达，从而调控紫杉醇在茎中的生物合成。红豆杉茎不同结构中紫杉烷类代谢物存在差异，这说明红豆杉的整个茎皆具有生物技术应用价值。在紫杉醇的生物合成的转录调控中发挥了作用的TmMYB3是韧皮部特有的，这也就解释了为什么紫杉醇会在韧皮部积累。
背景介绍

紫杉醇是最重要的化疗药物之一，其对卵巢癌、乳腺癌和头颈癌的疗效已被广泛证实。红豆杉是紫杉醇及其衍生物的天然来源，其重要性已经在很多生物学、植物化学、组学研究中被提及。几十年来，红豆杉的商用价值吸引了众多研究。紫杉醇结构复杂，红豆杉中鉴定到的紫杉醇的衍生物约400种。紫杉醇的生物合成过程，从二萜前体到终产物一共19步。
说说组学方面，红豆杉的组学做了很多，鉴定到了非常多的紫杉醇合成途径中的代谢物和蛋白质。关于紫杉醇的积累量研究已有一些内容：在代谢组学的研究中发现，大多数紫杉醇合成的中间产物在不同的红豆杉物种中差别很大，这也许能解释为什么它们对于紫杉醇的累积量不同。而蛋白组学的研究中，已经发现四种在MEP途径中的酶和三种细胞色素P450紫杉醇氧合酶是可以决定不同红豆杉物种的紫杉醇积累量的。结合蛋白组和代谢组的结果，可以看出MEP途径中的两个关键酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase (HDR)）是调控紫杉醇产出的关键酶。近年来，许多转录因子(transcription factors, TFs)被报道在不同紫杉醇生物合成相关基因的转录调控中发挥重要作用。在这些TFs中，MYC家族成员被认为参与了茉莉酸(JA)信号转导的调控，参与了紫杉醇的生物合成。有研究表明，三种基本的具有螺旋-环-螺旋(bHLH)的转录因子：TcJAMYC1、TcJAMYC2和TcJAMYC4，负调控东北红豆杉（Taxus cuspidata）中紫杉醇生物合成基因的表达。另有研究表明，TcMYC2a可能通过JA信号通路的乙烯反应因子(ERF)调节因子来调控中国红豆杉中TS、TAT、DBTNBT、T13OH和T5OH的表达。ERF12与ERF15通过与TS启动子中的JA反应元件中的GCC-box相结合，分别扮演者紫杉醇生物合成的抑制剂和激活剂的角色。WRKY转录因子TcWRKY1，参与了10-deacetylbaccatin-III-10-b-O-acetyltransferase (DABT)启动子的转录激活。另外两种WRKY TFs，TcWRKY8和TcWRKY47显著提高了几种紫杉醇生物合成相关基因的表达水平。植物的MYB转录因子家族有四个亚族，分别是1R-、R2R3-、R1R2R3-和4R-MYB，它们具有不同数量的MYB结构域重复。其中R2R3-MYB是一个大的亚族，其成员参与植物的次生代谢。在杨树中，MYB165和MYB194是类黄酮和苯丙醇生物合成途径的阻遏物。在桃子中，激活剂R2R3-MYB基因和抑制剂R2R3MYB基因PpMYB18来平衡花青素和前花青素的积累。然而，R2R3-MYB转录因子在紫杉醇生物合成调控中的作用尚不明确。药用化合物主要来源于植物茎皮。紫杉烷类物质，首次由太平洋红豆杉分离出，并在数百种红豆杉的茎皮中被发现。红豆杉茎皮中含有丰富的植物次级代谢产物，但紫杉烷类物质在不同的茎部结构的分布我们了解甚少。这篇文章中，作者选取曼迪亚红豆杉的皮层、韧皮部、木质部和髓部，进行代谢组和蛋白组的研究。另外，作者鉴定出一种韧皮部特异性的R2R3-MYB转录因子——TmMYB3，并探讨其在紫杉醇生物合成中的功能。进而阐明紫杉醇生物合成调控机制，促进高产品种选育。    不同茎部结构的紫杉烷类物质定量红豆杉茎皮广泛用于紫杉醇提取。通过简单的去皮，曼迪亚红豆杉茎部被分为皮层、韧皮部、木质部和髓部四个主要部分，从横截面图可以清楚看出。作者采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)对紫杉醇（PTX）、10-去乙酰紫杉醇(DAP)、BAC和10-DAB等4个重要的类紫杉醇类化合物进行定量。发现不同部位积累的紫杉烷类多有差异。紫杉醇和10-DAP主要在皮层和韧皮部积累，木质部的这些紫杉烷类含量是最低的。      不同茎部结构的的代谢谱为了研究不同结构的代谢谱，作者进行了非靶向代谢组学分析，每个部位设置了10个生物学重复。结合一级二级信息，在9512个信号中鉴定出5162个代谢物。通过总离子流图TIC、平均m/z分布、保留时间分布、代谢物强度分布等质控信息，可确定样本制备和仪器分析有效、原始数据质量高。主成分分析（PCA）显示，第一主成分和第二主成分解释率达到39.3%和15.51%。通过PCA以及聚类热图分析，可以看出四种结构聚类成三组，其中皮层和韧皮部代谢谱相似，聚类在一起。鉴定出的代谢物中有5077个被映射到不同代谢通路。映射到萜类和聚酮类代谢（metabolism of terpenoids and polyketides）最多，有275种，其次是氨基酸代谢（amino acid metabolism）的239种和脂质代谢（lipid metabolism）的224种。不同茎部结构的的蛋白谱为了研究不同结构的蛋白谱，作者进行了蛋白组学分析，每个部位设置了3个生物学重复。质控结果表明结果具有较高质量准确性。经搜库有效匹配132330个信号，鉴定出56902个肽段，其中47396个特异性肽段。经过滤后注释到5604个蛋白，其中4461个有定量信息。为了评估不同统计学分析结果的一致性，作者通过计算成对样本的皮尔森相关性系数、主城分析、标准差计算，均表明每组的三个生物学重复具有良好的重复性。对所有鉴定到的蛋白进行功能注释和亚细胞定位预测。其中GO功能注释最多的有：catalytic activity’ (2273 proteins), ‘metabolic process’ (2194 proteins), ‘binding’ (2031 proteins), ‘cellular process’ (1433 proteins) and ‘single-organism process’ (1344 proteins); KOG功能注释最多的有：‘general function prediction only’ (600 proteins), ‘post-translational modification’ (599 proteins) and ‘energy production and conversion’ (378 proteins); 亚细胞定位结果中：‘cytoplasm’ (1879 proteins), ‘chloroplast’ (1825 proteins) and ‘nucleus’ (999 proteins)。不同茎部结构的差异蛋白分析根据蛋白谱的聚类热图，可以看到不同结构都拥有特异性蛋白。总共鉴定出329个皮质蛋白、307个韧皮部蛋白、94个木质部蛋白和90个果皮特异性蛋白。作者研究了韧皮部特异性蛋白，旨在探讨其与韧皮部的紫杉醇特异性积累的关联性。307个韧皮部特异性蛋白通过代谢通路富集分析，富集到5个显著的代谢通路。为紫杉醇生物合成提供前体的“Terpenoid backbone biosynthesis”最为显著。用差异蛋白做GO分析，发现分子功能中，“氧化还原酶活性功能”占主导地位，生物过程中，“异戊二烯生物合成过程”是最主要的生物过程。蛋白组学分析中，鉴定出9个经典的转录因子：即MYB3、NAC25、GATA9-like、TCP2、TFIIB、bHLH82、WRKY31、DIVARICATA和TFIID。其中MYB3、NAC25和GATA9-like主要产生于韧皮部。代谢组学和蛋白组学通路整合分析紫杉醇生物合成是一个复杂的代谢途径，涉及很多中间代谢物和酶。在作者的研究中，12种参与了紫杉醇生物合成的中间代谢物被鉴定到：taxa-4(20),11(12)dien-5a-yl acetate, 10-DAB, 30-N-debenzoyl-20-deoxytaxol, 30-N-debenzoyltaxol and paclitaxel主要存在于韧皮部；taxa-4(5),11(12)-diene and taxa-4 (20),11(12)-dien-5a,13a-diol在木质部大量积累；taxa-4(20),11(12)-dien-5a-ol,10b,14b-dihydroxytaxa-4(20),11(12)-dien-5a-yl acetate and BAC主要存在于髓部。此外，还鉴定到10种紫杉醇生物合成相关酶。这里面大多数酶，如geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS), TS, taxadiene 5a-hydroxylase (T5aOH), taxadien-5a-ol O-acetyltransferase (TAT), taxane 10b-hydroxylase (T10bOH), TBT, DBAT, baccatin III:3amino-3-phenylpropanoyltransferase (BAPT) and DBTNBT，主要产生于韧皮部。红豆杉中含有一些的终端代谢产物以及14-羟基紫杉烷类代谢物，它们都是无法作用于紫杉醇的生物合成的。作者研究中鉴定出：四种髓部积累的类紫杉素代谢物（(+)-taxusin, 2a-hydroxytaxusin, 7b-hydroxytaxusin, 2a,7b-dihydroxytaxusin, and one 14-hydroxylated taxoid, taxuyunnanin C）；一种皮层、韧皮部积累的14-羟基紫杉烷类代谢物（14-hydroxylated taxoid）。并在髓部发现高水平产生的两种重要的酶（taxadiene-2a-hydroxylase (T2aOH) and taxane-7b-hydroxylase (T7bOH)）是参与紫杉素类代谢物的合成的，在皮层和韧皮部发现产生的Taxoid 14bhydroxylase (T14bOH)，是合成taxuyunnanin C的中间步骤。研究发现，紫杉醇生物合成相关酶主要存在于韧皮部，而参与紫杉醇生物合成的中间代谢物则分布在不同的茎组织中。作者的数据中展示了紫杉醇生物合成中的中间代谢物可能的迁移路线：GGPP, taxa-4(20),11(12)-dien-5a-ol, 10b,14b-dihydroxytaxa4(20),11(12)-dien-5a-yl acetate, BAC等代谢物可能是由韧皮部产生，随后转移到髓部的；taxa-4(5),11 (12)-diene可能是由韧皮部和髓部产生，随后转移到木质部；taxa-4(20),11(12)-dien-5a,13a-diol可能是由髓部产生，随后转移到木质部和韧皮部。10-deacetyl-2-debenzoylbaccatin III可能是由韧皮部产生，随后转移到皮层和髓部。分离紫杉醇合成相关基因的启动子区域
由于缺乏曼地亚紫杉醇的基因组信息，多数紫杉醇合成相关基因尚未被分离。作者用染色体步移法克隆了紫杉醇合成相关的5个基因（TS、T7OH、T13OH、TBT、DBTNBT）的部分启动子序列。为了研究其中潜在的调节因子，作者分析了这些启动子序列的已知转录因子motifs。发现，TS、TBT和DBTNBT三个基因的启动子序列至少包含一个经典的MYB结合元件(MBE)。有意思的是，TmMYB3是蛋白组学发现的韧皮部特有的转录因子。因此，作者后续的研究将重点关注TmMYB3在紫杉醇生物合成中的调控作用。TmMYB3的克隆及基本分析
以曼地亚红豆杉的转录组为基础，组装出TmMYB3的部分序列，以组装好的片段为模板，利用5’/3’的RACE扩增出TmMYB3的全长编码序列(CDS)。分析表明，TmMYB3可能编码一个分子量为28.0 kDa，等电点为7.26的一个具有257个氨基酸的蛋白。多序列比对的结果显示，TmMYB3在N端具有完整的R2R3结构域。在C端没有发现包含EAR或TLLLFR基序的抑制因子结构域。BLAST和序列分析的结果中发现TmMYB3与Gynura bicolor MYB1、Picea glauca MYB10和Ginkgo biloba MYB3蛋白有很大的相似性。为确定TmMYB3的亚细胞定位，作者在烟草表皮细胞中用增强型GFP标记TmMYB3。发现TmMYB3定位于细胞核，这个结果符合TmMYB3可能作为转录因子的预测。蛋白组的分析中，TmMYB3在韧皮部的含量最高。作者通过WB验证TmMYB3的韧皮部特异性，确定韧皮部的确存在大量的TmMYB3。TmMYB3结合TmTS、TmTBT、TmDBTNBT的启动子
为了探讨TmMYB3在紫杉醇生物合成相关基因的转录过程中的作用，作者通过体外凝胶迁移（EMSA）实验来研究这些基因是否是TMMYB3的作用靶点。首先对TmTBT、TmDBTNBT和TmTS的启动子序列进行TF motif分析，发现他们都可能具有一些MYB识别元件(MREs)。其中，TmTBT启动子上有1个MRE, DBTNBT启动子上有1个MRE, TmTS启动子上有2个MREs。制备TmMYB3- His融合蛋白和TmTBT、TmDBTNBT、TmTS的启动子片段，EMSA实验发现TmMYB3直接与TmTBT、TmDBTNBT、TmTS启动子的MREs结合。过量加入冷探针竞争有效降低His-TmMYB3融合蛋白与DNA的结合，过量加入突变探针则不影响其结合。作者也通过ChIP-qPCR实验进一步证实mMYB3在体内与这三个启动子的结合。对比IgG阴性对照的几乎无表达，在含MREs的启动子区域使用TmMYB3抗体得到很高信号。体内体外实验结果皆表明TmTBT、TmDBTNBT和TmTS可能是TmMYB3的下游靶基因。TmMYB3增强了TmTBT和TmTS的表达作者在本氏烟叶片做了双荧光素酶报告基因测定，确定TmMYB3在体内的转录活性。结果显示，TmMYB3有效激活了TmTBT和TmTS pro-LUC报告基因的表达，这说明TmMYB3通过直接与TmTBT和TmTS基因的启动子结合，起到转录激活剂的作用。不过TmDBTNBT基因的表达未被激活。   
总结

红豆杉茎皮部是紫杉醇提取的主要来源。市场对紫杉醇的需求日益增加，这招致了大量非法砍伐，数以千计的珍稀红豆杉被破坏。红豆杉价值斐然，然而目前对于红豆杉的代谢物和蛋白质的动力学研究却十分有限。
近年来，研究者们从红豆杉中分离出大量紫杉烷类代谢物，并发现紫杉烷类在红豆杉不同部位的含量和种类不尽相同且差异较大。对于茎部的各结构中的紫杉烷类代谢物的种类和含量，我们知之甚少。本文通过非靶向代谢组学方法，分析了皮层、韧皮部、木质部和髓部的代谢谱，展示了这些紫杉烷类药用化合物的部位特异性。韧皮部是次生代谢产物的生物合成和运输的重要场所。在挪威云杉的韧皮部中，收缩素、异丙糖和皮甲苷这些酚类二苯乙烯糖苷大量存在。在曼地亚红豆杉的韧皮部中，紫杉醇、10-DAB和DAP大量积累。这说明韧皮部或是紫杉醇提取的重要来源材料。事实上不止茎皮部位，在髓部也发现了大量的BAC。这说明红豆杉树干亦或是很有价值的材料，并可能是紫杉醇合成关键前体的重要来源。多种类紫杉醇代谢物是终端代谢产物，并非紫杉醇合成的中间体。有研究推测，一些紫杉醇生物合成中的代谢物是由紫杉醇的受保护衍生物中的C9、C10位置的羟基进行巴顿去氧反应得到。多年来，人们一直以为紫杉素类代谢物主要积累在紫衫木心材中。而作者的代谢组学结果中，紫杉素类代谢物主要是在植物的髓部而非木质部。通过了解紫杉素类代谢物在茎结构中的分布，将有助于研究红豆杉中重要的旁支途径的代谢物的利用过程。韧皮部是一个关键的茎部结构，其间生物分子通过影响植物与环境的相互作用来调节植物的胁迫耐受力。韧皮部大量积累的黄酮类代谢物，其生物合成的激活，会在植物抵抗环境胁迫中发挥着重要作用。本文中代谢组的研究发现，韧皮部和皮层的初级、次级代谢产物比较相似，髓部的脂质和萜类代谢物含量均大于其余茎部组织。茎的各部位的代谢物组成各有不同，这说明曼地亚红豆杉的整个茎都具有广泛的生物技术应用潜力。作者发现，紫杉醇合成途径中的酶以及中间代谢物，在不同茎结构中的含量是有差异的。比如：产生于韧皮部的TS的下游产物taxa-4(5),11(12)-diene主要存在于木质部；积累于韧皮部的10-DAB的下游产物BAC又在髓部积累。作者的结果中展示了这些中间产物在不同茎结构中的转移。与紫杉烷类代谢物情况相似的有赤霉素(GA)，这是一种二萜类化合物，其在植物各部位的移动近年来也得到很多研究。赤霉素在韧皮部汁液中的定量以及在韧皮部的转移现象都有研究。其中GA12由根到芽穿过木质部，由芽到根穿过韧皮部。赤霉素转运蛋白可用于预测赤霉素的细胞间和组织间的移动。然而紫杉烷类的转运蛋白尚未发现。除了主动运输，紫杉烷类代谢物通过细胞膜扩散的能力或许可以解释其在各茎部结构移动的现象。代谢工程学的研究或对紫杉醇产量会有一定帮助。然而提高产量的关键在于了解紫杉醇生物合成途径的调控机制。转录因子(TFs)通过调节特定的生物合成途径增加药用植物中生物活性成分的积累量。曼地亚红豆杉是紫杉醇含量较高的栽培红豆杉种，是紫杉醇工业生产的主要来源。作者的前期的研究中发现了曼地亚红豆杉中紫杉醇生物合成途径中的大部分基因，为进一步研究紫杉醇生物合成的转录调控奠定了坚实的基础。在其他红豆杉物种中，包括东北红豆杉和中国红豆杉的MYCs、中国红豆杉的WRKYs和中国红豆杉的ERFs被认为参与了紫杉醇的生物合成途径。到目前为止，在红豆杉物种中还没有发现MYB转录因子（MYB TF）的功能鉴定。本文研究中，在曼地亚红豆杉中发现了R2R3-MYB TF和TmMYB3。在植物中，次生代谢是一个复杂的调控网络，MYB TF是其中的重要组成部分。已有研究表明，R2R3-MYB TFs通过调节MEP通路基因DXS、DXR、GGPPS的表达，调控萜类生物合成。在甜叶菊中，MYB TFs被认为控制MEP和甲羟戊酸途径的下游代谢通量。紫杉醇是一种以二萜紫杉醇为核心构建的生物活性物质，参与紫杉醇生物合成的关键基因的表达可能也受到MYB TFs的调控。R2R3-MYB的序列特异性DNA结合位点已在模式植物中得到证实。由于红豆杉基因组未知，需要通过启动子序列的克隆来探索TFs与其靶基因之间的关系。采用东北红豆杉悬浮细胞，分离出7个已知紫杉醇途径基因的启动子。在中国红豆杉研究中，TS的550 bp的的5’端侧翼序列和DBAT的1740 bp的5’端-侧翼序列已被报道。此外，利用红豆杉细胞培养发现了BAPT的Y-patch启动子区域的作用。为了验证TmMYB3的靶基因，我们分离了5个重要的紫杉醇生物合成相关基因的启动子序列。分析MREs后，在曼地亚红豆杉中鉴定出3个潜在的靶基因TmMYB3、TS、TBT和DBTNBT。紫杉醇合成酶催化紫杉醇生物合成的关键步骤是通过中间体GGPP生成紫杉烷核心，TBT催化10-deacetyl-2-debenzoylbaccatin III转化为10-DAB，DBTNBT催化3’N-debenzoyltaxol转化为目标化合物紫杉醇。这三种酶在紫杉醇生物合成中都起着重要的作用。在此，在TS、TBT和DBTNBT基因的启动子序列中至少发现了一个潜在的MBE，EMSA实验证实了TmMYB3与这三个启动子的结合。虽然发生了物理结合，但究竟TmMYB3具体是如何调控下游靶基因，是激活还是抑制？这仍有待进一步研究。例如，中国红豆杉中TcMYC2可以激活TS, TAT, DBTNBT, T13OH 和T5OH的表达。也有发现中国红豆杉中TcWRKY8和TcWRKY47在紫杉醇生物合成中起转录激活剂的作用。茉莉酸(JA)的两个响应因子，TcERF12和TcERF15，分别作为TS基因的抑制因子和激活因子。在作者的研究中，双荧光素酶报告基因测定显示TmMYB3影响TS和TBT启动子的转录激活，而对DBTNBT无影响。虽然参与紫杉醇生物合成的中间代谢物大部分可能在韧皮部产生，但也有一些中间代谢物积累在不同的茎部结构中。TS的下游产物taxa-4 (5),11(12)-diene被转移到木质部，而TBT的上游产物10-deacetyl-2-debenzoylbaccatin III被转移到髓部和皮层。综上所述，TmMYB3正向调节紫杉醇生物合成，可能是通过激活TmTBT和TmTS的表达来实现调控作用。此外，作者还预测了TS和TBT相关的产物在不同茎组织间可能的转移现象。综上，红豆杉不同茎部结构的代谢组学和蛋白组学整合分析，为紫杉烷类药用代谢物在不同部位积累的现象提供了一个分子机制框架。不同茎部结构的不同代谢物组成展示了生物技术应用的广泛潜力。此外，TmMYB3作为一种韧皮部特异性的TF，通过激活TS和TBT基因的表达，对紫杉醇的生物合成产生显著的影响，为紫杉醇的韧皮部的大量积累提供了一种可能的解释。
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