血液循环微生物DNA可作肿瘤标志物？| 血液微生物组
微生物组与肿瘤发生、治疗、预后的紧密关系以及作为肿瘤筛查标志物的研究已有众多报道。肿瘤相关微生物的研究已从瘤外微生物进展到瘤内微生物(Sepich-Poore et al., 2021)（图1）（最近发Cell的肿瘤微生物组，你都了解吗？）。
图1 肿瘤微生物组研究全景
彩色圆点中的数字是参考文献号
前人的研究已经揭示出一些细菌的致癌机制（表1）。在结直肠癌研究中，人们发现肿瘤组织中明显富含具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）。具核梭杆菌通过两种粘附素（梭杆菌黏附素A，梭杆菌转运蛋白2）促进结直肠癌的进展(Gur et al., 2015; Rubinstein et al., 2013)。大家熟知的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种革兰氏阴性菌，定居在胃粘膜，其产生的细胞毒素相关基因A蛋白（CagA）可以直接进入胃上皮细胞，引起慢性炎症和DNA损伤，从而诱导胃癌的发生(Hardbower et al., 2013)。产肠毒素脆弱类杆菌（Enterotoxigenic Bacteroides fragilis）会促进乳腺上皮细胞增殖，诱导乳腺导管肿瘤生长甚至转移。从机制上讲，脆弱类杆菌毒素是通过β-catenin和Notch1轴促进肿瘤的发生(Lopez et al., 2021)。也有研究将肺部微生物引起的炎症与肺癌的发生联系在一起。利用小鼠模型，研究人员发现，肺部微生物群通过刺激依赖于Myd88的IL-1β和IL-23，并诱导γδT细胞的增殖和激活来促进炎症和肿瘤的发生(Jin et al., 2019)。此外，微生物群落与患者对癌症治疗的应答之间也存在相关性。V‘etisou等人发现脆弱类杆菌可提高对CTLA-4阻断介导的抗肿瘤免疫治疗的应答，提示脆弱类杆菌可能是一种良好的乳腺癌预后生物标志物(Vétizou et al., 2015)。我们合作的课题组也有许多工作是探讨肿瘤筛查或是治疗相关的菌群标志物（NC文章教你做高质量的肠道菌群队列研究；10分项目文章：不做机制，也能出高分文章；8分+项目文章：除了肠道菌群，这里的菌群也大有可为！）。
表1 特定微生物致癌机制
越来越多的研究发现，血液中的循环微生物DNA（circulating microbiome DNA，cmDNA）可能是肿瘤检测中的新玩家（表2）。Dong等人研究发现，胃癌患者的血清微生物组明显不同于对照组，并且微生物组成的变化与胃癌患者的病理阶段相关( Dong et al., 2019)。Kim等人建立了一种诊断模型，通过对血清微生物来源的细胞外囊泡进行宏基因组分析来区分卵巢癌和良性卵巢肿瘤(Kim et al., 2020)。Cho等人发现肝硬化和肝细胞癌患者之间几种细菌类群的丰度存在显著差异。通过比较肝细胞癌患者(n = 79)、肝硬化患者(n = 83)和健康对照组(n = 201)血清中的细菌DNA，发现肝细胞癌患者的循环微生物多样性显著下降。由此开发了一个由5种微生物基因组成的模型来区分肝细胞癌和健康个体(Cho et al., 2019)。近期一项有重要影响力的工作是，2020年Poore等人在Nature报道血浆中的cmDNA能用来区分健康人和癌症患者以及不同癌症类型(Poore et al., 2020)（Nature：Rob Knight团队发现血液和组织微生物组可诊断癌症）。研究人员通过人工智能（AI）机器学习等多种方法对33种癌症的全基因组和全转录组数据进行归类分析，鉴定出与肿瘤类型相关的微生物特征，能够仅使用患者血浆中的微生物DNA来区分不同的癌症类型。上述研究表明，cmDNA可能是一种有前途的肿瘤检测的非侵入性生物标志物。
表2 循环微生物组作为癌症诊断生物标志物的证据
首先，cmDNA的起源仍然不清楚。如“血液中的微生物从何而来？”中所述，微生物能够从肠道、皮肤、口腔或其他器官进入血液。然而，cmDNA的起源仍然是一个谜，需要对它的来源做深入探索，以验证这个新方法在癌症检测中的有效性。
其次，开展cmDNA的有效检测并不容易。相比于血液中来自宿主的DNA，cmDNA的含量是极低的。尽管常规的16S测序（如V3-V4）可以用于cmDNA的检测，但是对于低微生物生物量的样本，它的检测灵敏度较低，检出率一般，使得血液微生物组的研究受限。目前也有一些血液微生物组研究采用宏基因组测序，然而血液中宿主DNA含量较高，测序获得的菌群数据非常少，也不利于血液微生物组的全面挖掘。此前，我们介绍过一种新的16S测序技术—5R 16S测序，即对16S rRNA基因上的五个区域（V2、V3、V5、V6、V8）进行多重PCR扩增和测序（图2）。与V3V4区扩增策略相比，5R 16S测序技术可以扩增出的区域覆盖约68%的16S全长序列，可以大幅提高细菌物种检测的覆盖率和分辨率（种水平），并且特别适合于低生物量的微生物样本检测，比如肿瘤组织内微生物检测（最近发Cell的肿瘤微生物组，你都了解吗？），当然也适用于血液微生物组检测。我们已使用5R 16S测序技术开展了近百个血液微生物组项目的检测，相比于常规16S测序，获得了更高的检出率。
图2 5R 16S扩增16S rRNA基因的5个区域
灰色的R1-R5表示5R 16S扩增的5个区域
第三，实验中的污染菌去除。因为血液中微生物是微量的，排除来自环境、采样、实验试剂和仪器等所带入的菌群污染，显得尤为重要。比如在核酸提取、PCR扩增过程中设置一定数量的阴性对照，与实验样本一起完成整个实验流程和测序，进而鉴定出哪些菌可能是污染菌而需要排除。我们在开展肿瘤微生物组检测项目中积累的经验可以借鉴（做肿瘤微生物检测，这些实验设计你都知道吗？）。
第四，cmDNA不仅是血液中循环细菌DNA，也可以是循环真菌和病毒的DNA。乙肝病毒、人乳头瘤病毒和EB病毒分别是国际癌症研究机构指定的肝癌、宫颈癌和鼻咽癌的致癌因素(de Martel et al., 2012)。因此，有理由假设循环真菌和病毒DNA的变化也可以用于区分恶性和良性病变。尽管目前对它们开展检测的工作少有报道，但这无疑也是一个非常有潜力的研究方向。
de Martel, C., Ferlay, J., Franceschi, S., et al. (2012). Global burden of cancers attributable to infections in 2008: a review and synthetic analysis. The Lancet. Oncology, 13(6), 607–615.
Dong, Z., Chen, B., Pan, H., et al. (2019). Detection of Microbial 16S rRNA Gene in the Serum of Patients With Gastric Cancer. Frontiers in oncology, 9, 608.
Gur, C., Ibrahim, Y., Isaacson, B., et al. (2015). Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack. Immunity, 42(2), 344–355.
Hardbower, D. M., de Sablet, T., Chaturvedi, R., & Wilson, K. T. (2013). Chronic inflammation and oxidative stress: the smoking gun for Helicobacter pylori-induced gastric cancer?. Gut microbes, 4(6), 475–481.
Jin, C., Lagoudas, G. K., Zhao, C., et al. (2019). Commensal Microbiota Promote Lung Cancer Development via γδ T Cells. Cell, 176(5), 998–1013.e16.
Kim, S. I., Kang, N., Leem, S., et al. (2020). Metagenomic Analysis of Serum Microbe-Derived Extracellular Vesicles and Diagnostic Models to Differentiate Ovarian Cancer and Benign Ovarian Tumor. Cancers, 12(5), 1309.
Lopez, L. R., Bleich, R. M., & Arthur, J. C. (2021). Microbiota Effects on Carcinogenesis: Initiation, Promotion, and Progression. Annual review of medicine, 72, 243–261.
Poore, G. D., Kopylova, E., Zhu, Q., et al. (2020). Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature, 579(7800), 567–574.
Rubinstein, M. R., Wang, X., Liu, W., et al. (2013). Fusobacterium nucleatum promotes colorectal carcinogenesis by modulating E-cadherin/β-catenin signaling via its FadA adhesin. Cell host & microbe, 14(2), 195–206.
Sepich-Poore, G. D., Zitvogel, L., Straussman, R., et al. (2021). The microbiome and human cancer. Science, 371(6536), eabc4552.
Vétizou, M., Pitt, J. M., Daillère, R., et al. (2015). Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota. Science, 350(6264), 1079–1084.
Xiao, Q., Lu, W., Kong, X., et al. (2021). Alterations of circulating bacterial DNA in colorectal cancer and adenoma: A proof-of-concept study. Cancer letters, 499, 201–208.
Zozaya-Valdés, E., Wong, S. Q., Raleigh, J., et al. (2021). Detection of cell-free microbial DNA using a contaminant-controlled analysis framework. Genome biology, 22(1), 187.
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