功能基因篇：一文带你了解氮循环功能基因 | 微生物专题

01微生物氮循环的发展历程

氮是生物所必需的营养元素，是一切生命的物质基础。自然界中氨循环是生物圈内基本的物质循环之一，对农田、草地、森林、沼泽等生态系统的生产力和可持续发展具有重要作用。氮循环包括生物硝化作用、反硝化作用、固氮作用和氨化作用、厌氧氨氧化以及硝酸盐异化还原成胺等众多生物过程，这些过程均由微生物所驱动的氮素循环过程，主要通过铵态氮减少，硝态氮增加，NO、N₂O、N₂的释放的释放，引起整个过程中氮素的波动（图1）。其中厌氧氨氧化作用、氨氧化古菌分别是在1995年和2005年在自然界中发现^[1-2]。氮循环(nitrogen cycle)是氮元素在地球大气圈、生物圈、土壤圈、水圈之间迁移转化和周转循环的过程，其主要来源是大气中的氮气。随着分子生物学技术的不断突破，人们对微生物所驱动的氮循环过程有了全面的认识。

图1 微生物参与的氮循环过程

02生物氮转化途径

在自然界的各类环境中有一些具有特殊功能的微生物，如固氨菌、反硝化菌、氨氧化细菌、甲烷氧化菌等。每种功能微生物在分类学上可能有很大不同，但却具有类似的基因使其能够发挥同样的功能，如硝化作用(古菌amoA、细菌amoA、hao、nxrA基因)，反硝化作用(narG、nirS、nirK、norB、nosZ基因)，同化氮还原作用(nasA、narB、nirA、nirB基因)，异化氮还原成铵作用(napA、nrfA基因)，氮固定作用(nifH基因)等。植物吸收士壤中的铵盐和硝酸盐，进而将这些无机氮同化成植物体内的蛋白质等有机氮；动物直接或间接以植物为食物，将植物体内的有机氮同化成动物体内的有机氮，这一过程为生物体内有机氮的合成。氨化作用是动植物的遗体、排出物和残落物中的有机氮被微生物分解后形成氨，由于微生物种类以及氧条件的差异，NO₃^-还原主要可区分为同化还原和异化还原途径。同化还原的目的是利用NO₃^-合成细胞物质，整个过程中既没有NO₃^-的积累，也没有NO₄⁺的产生。异化还原过程则可根据产物的不同再分为两种途径，一种途径以N₂O、N₂为产物，称为反硝化(Denitrification)；另一途径以NH₄⁺为产物，称为硝态氮异化还原成铵^[3]。硝化作用是在有氧的条件下，土壤中的氨或铵盐在硝化细菌的作用下最终氧化成硝酸盐；氨化作用和硝化作用产生的无机氮，都能被植物吸收利用，土壤氨氧化微生物主要包括氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）。不同降温策略下混合硝化细菌的硝化性能，活性和群落动态研究中对硝化细菌的硝化性能有具体的阐述。反硝化作用在氧气不足的条件下，土壤中的硝酸盐被反硝化细菌等多种微生物还原成亚硝酸盐，并目进一步还原成分子态氮，分子态氮则返回到大气中。反硝化过程是典型的酶促反应，不同的酶催化和调节不同反应途径。反硝化微生物在土壤中普遍存在，存在于自养和异养细菌中，且占细菌总数的0.5%~5%^[4]。研究结果表明，不同类型的反硝化微生物种群具有不同的反硝化速率，产生不同的气体比例^[5]。在反硝化气体为 N₂O 和 N₂的比例不同，环境中反硝化微生物的群落结构也发生明显改变。

图2 生物氮转化途径

03微生物功能基因的作用

土壤环境是地球上“微生物多样性”最丰富的区域，土壤已成为氮循环中最活跃的区域。硝态氮是土壤氮素的重要形态，在厌氧环境下极易被还原。对我国4种富氮湿地土壤中氨氧化细菌、古菌多样性和丰度的研究表明，表层土壤中高浓度的铵，导致氨氧化古菌数量明显低于氨氧化细菌^[6]，说明NH₄⁺中氮浓度是影响氨氧化微生物的关键因素，其含量的升高必然会影响对其敏感的微生物类群的生长繁殖^[7]，如酸微菌纲(Acidimicrobiia)、α-变形菌纲和β-变形菌纲丰度的升高与NH₄⁺-N含量的提高有关。然而，铵态氮过量会严重阻碍某些微生物的生长，甚至对其产生毒害作用，如过量的铵态氮能降低甲烷氧化菌的丰度。

生物固氮是自然生态系统中氮循环的重要环节，固氮微生物在形态及功能上具有显著的多样性，种属范围分布广泛，包括厌氧、兼性厌氧和好氧微生物，其固氮作用方式分为自生固氮、联合固氮和共生固氮。由钼铁蛋白和铁蛋白组成的铅铁固氮酶是固氮微生物细胞中最为普遍的一类固氮酶体系，在固氮微生物不同种间，nifH基因编码的铁蛋白的氨基酸序列存在很高的同源性，且利用nifH基因和16S rRNA基因序列分别构建的系统发育树有一致的进化表征特性。因此，nifH基因常被用作标记基因检测各生态环境中固氮微生物的群落结构及其多样性。此外，生物硝化/反硝化是去除含氨高浓度废水中氮的常用方法。随着高通量测序的发展，研究学者利用llumina高通量测序以及结合分子生物学方法，全面描述在好氧和厌氧环境中硝化和反硝化菌群结构和功能^[8]，qPCR和宏基因组分析功能基因amoA、nirK、nirS和nosZ存在很好的相关性，说明环境中宏基因组测序可用于全面探讨硝化/反硝化菌功能基因的丰度。

位于陆海交界面的滨海湿地通常具有较高的生物生产力，在湿地环境污染治理中功能基因研究至关重要。杨平等研究表明将盐沼湿地垦殖成养殖塘降低了沉积物氮素有效性以及氨氧化、亚硝酸盐还原和氧化亚氮还原功能基因丰度，从而降低了N₂O排放^[11]。聂世清等利用鸟枪宏基因组测序和定量聚合酶链反应（qPCR）方法对北部湾亚热带红树林湿地生态系统的氮循环进行了研究阐明了脱硫菌减轻氮污染的机制^[12]。Mohammad Bahram等对全球645个湿地土壤样本进行原位N₂O测量，发现在排水和温暖的湿地土壤中，N2O排放量较高，并且与微生物的功能多样性相关^[13]。持续的全球变暖和不断加剧的环境变化可能会促进古细菌硝化菌的生长，共同使湿地土壤转释放更多的N₂O。李涛等采用宏基因组测序和同位素示踪技术发现黄河湿地与人工湿地微生物群落结构差异极显著，厌氧氨氧化和反硝化速率与样本中厌氧氨氧化菌和反硝化菌丰度分布规律一致^[14]。湿地生态系统微生物可以通过宏基因组、16S rDNA测序或定制PCR测序等手段进行研究，能够很好地探明微生物氮功能基因在生态系统中的功能，并且可以支撑氮循环和N₂O微生物活动的平衡。

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参考文献：

1、Mulder,A.,Graaf,A.A.,Robertson,L.A.Kuenen,J.G.Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor.FEMS Microbiology Ecology16,177-184

2、Konneke,M.et al.Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon.Nature 437,543-546

3、Donald E.et al.The Evolution and Future of Earth's Nitrogen Cycle.Science

4、Henry S, Bru D, Stres B, Hallet S, Philippot L et al. 2006. Quantitative detection of the nosZ gene,

encoding nitrous oxide reductase, and comparison of the abundances of 16S rRNA, narG, nirK, and

nosZ genes in soils. Applied and Environmental Microbiology, 72, 5181e5189

5、Smith J, Wagner-Riddle C, Dunfield K. 2010. Season and management related changes in the diversity of nitrifying and denitrifying bacteria over winter and spring. Applied SoilEcology, 44(2): 138-146
6、Wang Y.et al.Manure fertilization alters the population of ammonia-oxidizing bacteria rather than ammonia-oxidizing archaea in a paddy soilJ Basic Microbiol,543.190-7

7、Ahn,J.H.et al.Characterization of the bacterial and archaeal communities in rice field soils subjected to long-term fertilization practices.Journal of microbiology 50,754-765

8、Wang,Z.et al.Abundance and diversity of bacterial nitrifiers and denitrifiers and their functional genes in tannery wastewater treatment plants revealed by high-throughput sequencing.PloS one 9,e113603

10、Smith J, Wagner-Riddle C, Dunfield K. 2010. Season and management related changes in the diversity of nitrifying and denitrifying bacteria over winter and spring. Applied SoilEcology, 44(2): 138-146

11、Conversion of coastal wetland to aquaculture ponds decreased N2O emission: Evidence from a multi-year field study

12、Nie S , Zhang Z , Mo S , et al. Desulfobacterales stimulates nitrate reduction in the mangrove ecosystem of a subtropical gulf[J]. Science of The Total Environment, 2021, 769:144562.

13、Mohammad Bahram , et al.Structure and function of the soil microbiome underlying N2O emissions from global wetlands,2022

14、Li T , Zhou Y , Yang F , et al. Impact of environmental factors on the diversity of nitrogen-removal bacteria in wetlands in the Sanmenxia Reservoir of the Yellow River[J]. Journal of Soils and Sediments, 2023, 23(1):512-525.

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