用户文章-PBJ：m6A测序揭示阅读蛋白MhYTP2调控苹果白粉病抗性的分子机制-转录调控专题
论文标题：The m6A reader MhYTP2 regulates MdMLO19 mRNA stability and antioxidant genes translation efficiency conferring powdery mildew resistance in apple
刊登日期：2021年10月
发表杂志：Plant Biotechnology Journal
影响因子：17.694
研究机构：西北农林科技大学园艺学院
技术手段：m6A测序、翻译组测序
研究背景
白粉病（PM）是苹果上的一种严重真菌病害，主要为害幼嫩的绿色组织，受感染的叶片会起皱、卷曲并过早脱落，影响苹果果实发育和品质形成，降低果实产量和经济价值，而目前关于苹果白粉病抗性基因的挖掘工作开展较少。
主要研究内容：01科技与创新过表达MhYTP2增加对PM的抗性且改变m6A writer和erasers的表达水平
MhYTP2是一个PM抗性的基因型，为探索MhYTP2在抗PM方面的功能。作者选择3个35S::MhYTP2株系(OE-1, OE-2, OE-3)进行实验，与WT植株相比对PM的抗性增强。通过敏感性实验，在人工接种PM后，35S::MhYTP2株系的疾病严重程度低于WT株系（图1a-d）。
MhYTP2与拟南芥ECT2（一种m6A reader ）的同源性很高，具有YTH结构域，即作者推测MhYTP2也是m6A reader，可能会影响mRNA的甲基化水平。作者通过分析35S::MhYTP2株系和WT植物中几个重要的甲基转移酶和去甲基化酶基因的表达水平，研究MhYTP2对mRNA甲基化水平的影响。结果表明过表达MhYTP2会改变m6A writer和erasers的表达水平，其可能影响苹果整体甲基化水平（图1a-b）。
图1 过表达MhYTP2增加对PM的抗性（a-d）且改变m6A writer和erasers的表达水平（a-b）
图2 35S：MhYTP2品系OE-2与WT间的甲基组变异
接着，作者通过m6A-seq探究了MhYTP2品系OE-2与WT间的甲基组变异情况，以探究MhYTP2对mRNA甲基化的潜在影响。结果显示在WT和35S::MhYTP2株系OE-2叶中共鉴定出15,225和17,303个高信度m6A峰；与WT植株相比，35S::MhYTP2株系的OE-2中12484个转录本显示m6A水平增加，而只有2024个转录本显示m6A富集降低，表明35S::MhYTP2株系OE-2的m6A甲基化整体增加(图2a)；此外，KEGG分析表明35S:: MhYTP2株系OE-2中上调的转录本在RNA降解和植物-病原相互作用途径中富集。下调的转录本主要富集在激素信号转导和类黄酮途径的生物合成中，提示MhYTP2在多个生物过程中发挥关键作用（图2b）。另外，在35S:: MhYTP2株系OE-2中UTRs周围的m6A修饰比在WT植物中高度富集(图2c)，揭示了MhYTP2对m6A修饰mRNA的稳定性和翻译具有重要影响。通过超几何富集分析（HOMER）在苹果中存在与拟南芥、番茄和玉米中的“URUAY”序列相似，表明m6A修饰在植物物种之间保守的(图2d)。另外，作者通过RNA-seq评估苹果中m6A mRNA甲基化与基因转录水平之间的潜在相关性，结果表明外显子区域的m6A修饰后mRNA稳定性降低，而UTRs中的m6A与相关mRNA的丰度呈正相关(图3e)。MdMLO19基因作为PM感病基因，在35S::MhYTP2株系OE-2中发现MdMLO19-X1，相比于WT植株在外显子区域m6A高甲基化（图2f）。
与WT植物相比，在35S::MhYTP2株系OE-2中，放线菌素D处理后MdMLO19和MdMLO19- x1转录本的降解速度很快(图3g)，这表明m6A修饰促进了MdMLO19和MdMLO19- x1 mRNA的降解。另外，接种PM后，35S:: MhYTP2株系OE-2中MdMLO19和MdMLO19- x1的表达水平明显低于WT植株(图3h)。
图3 MhYTP2增强了MhYTP2靶标和非靶标转录本的翻译
图4 MhYTP2提高了MdGDH1L的翻译效率
为探讨MhYTP2在mRNA翻译中的作用，作者通过核糖体谱法评估过表达和未过表达MhYTP2的转录mRNA的核糖体密度。结合RIP-seq结果的进一步分析显示，MhYTP2过表达增强了MhYTP2靶标和非靶标的翻译效率(图3b)。不同核糖体占用转录本的GO分析表明MhYTP2转录本在抗氧化系统中富集(图3c)，提示MhYTP2对苹果抗氧化系统具有重要影响。
与WT植物相比，35S::MhYTP2品系的不同核糖体占据转录本在抗氧化酶中富集(图3c)，包括影响GSH合成的MdGDH1L。35S:: MhYTP2株系OE -2和WT植物的m6A-seq分析表明MdGDH1L mRNA在3’UTR处含有m6A位点。MdGDH1L的m6A修饰水平在35S::MhYTP2株系OE-2中显著高于WT植物(图4a)。EMSA显示MhYTP2与m6a修饰的MdGDH1L mRNA结合(图4b)。此外，通过在35S:: MhYTP2株系OE-2中进行核糖体分析，发现MdGDH1L mRNA的翻译效率整体增加(图4c)。此外，35S:: MhYTP2的GDH活性明显高于WT(图4d)。在正常培养和PM接种条件下，35S::MhYTP2品系的GSH和AsA水平高于WT植株(图4e)。以上结果表明，MhYTP2过表达提高了其靶标MdGDH1L mRNA的翻译效率，导致更多的MdGDH1L蛋白和更高的抗氧化活性，从而增强了PM抗性(图4f)，抗氧化系统中的关键基因经过m6A介导的转录后调控，促进翻译以增加蛋白质含量，以应对应激。
04MhYTP2调节编码转录伸长因子和翻译起始因子的基因图5 MhYTP2调节编码转录延伸因子和翻译起始因子的基因，间接提高几个抗氧化基因的翻译效率
过表达MhYTP2，L-抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因和过氧化物酶（PER）基因的翻译效率发生显著变化(图5a)。对m6A-seq和RIP-seq数据的详细分析显示在35S:: MhYTP2株系OE -2中UTR中表现出m6A高甲基化(图5b)。RIP分析显示MhYTP2与MD17G1038800，MD14G1104300和MD10G1126600的转录本之间存在直接相互作用（图5c）。 综上所述，除了直接与m6a修饰的靶标如MdGDH1L mRNA结合调节翻译效率外，MhYTP2还可能通过调控转录延伸因子和翻译起始因子的m6a修饰的mRNA间接调节其非靶标的翻译效率。结果表明，MhYTP2通过快速降解MdMLO19和MdMLO19- x1 mrna和提高抗氧化基因的翻译效率来提高抗PM能力。（三）
总结
该研究在明确苹果的MhYTP2具有m6A结合功能的前提下，通过检测转基因材料中m6A甲基化酶和去甲基化酶相关基因的表达水平，作者发现MhYTP2的过表达会改变m6A甲基化酶和去甲基化酶相关基因的表达；另外，通过联合m6A-seq、RNA-seq和Ribo-seq发现MhYTP2过表达增加了一批mRNA的m6A修饰水平和翻译效率。外显子区域的m6A修饰水平可能与mRNA的稳定性呈负相关，而非翻译区（UTR）则相反。另外MhYTP2过表达增强了苹果白粉病抗性，可能是通过快速降解MdMLO19和MdMLO19- x1的结合mRNA，提高抗氧化基因的翻译效率。该研究结果揭示了苹果m6A基因谱、MhYTP2对m6A基因谱的影响以及m6A在调控苹果白粉病感病基因MdMLO19 mRNA稳定性和抗氧化相关基因翻译效率中的作用。
图6 苹果PM抗病中MhYTP2功能的模型
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