肿瘤微生物组新知：肿瘤内微生物群在癌症转移中的新作用 | 微生物专题
论文标题：Emerging roles of intratumor microbiota in cancer metastasis
刊登日期：2022年12月
发表杂志：Trends in Cell Biology
影响因子：21.167
研究机构：西湖大学
癌症转移是恶性肿瘤发展的关键环节，由癌细胞自身特性和外部环境因素共同决定。肿瘤内微生物群是一种新型癌症成分，在功能上影响广泛癌症类型的肿瘤进展。肿瘤组织中存在低丰度和低多样性的肿瘤内微生物群，主要定位于细胞内。肿瘤内微生物群涉及区分正常组织与癌症组织、预后好与坏、转移性与非转移性癌症。调节肿瘤内微生物群可以减少癌症转移，阻碍癌症进展，并重新编程免疫反应。
癌症患者死亡的主要原因是癌症转移，癌细胞转移主要受癌细胞自身特性和细胞外部环境影响。近年来，肿瘤内微生物群已被确定为肿瘤的一个组成部分，并可能在功能上参与癌细胞转移调节。肿瘤内微生物群的发现改变了研究学者对癌症转移的理解，为癌症进展和临床癌症研究揭示了新的途径。本文综述了肿瘤内微生物群在癌症转移中的最新进展，并讨论了癌症治疗面临的挑战和现实意义。
最早对癌症转移的认识从100年前StephenPaget提出的“种子和土壤”模型，主张转移需要肿瘤细胞传播即“种子”，受纳器官理想的环境即“肥沃的土壤”。到近几十年涉及的上皮间质转化（EMT）的细胞转化模型，即使癌细胞脱离原发肿瘤并扩散到其他地方。再到近年来关注的肿瘤微环境（TME）影响癌症转移多样化的假设[1-2]。尽管存在这些不同的假设，但癌症转移始终被定义为肿瘤从原始肿瘤部位转移到远端器官的多步骤过程，涉及侵入、扩散、内渗、外渗和定植几个步骤[1-5]。癌症转移的关键特征之一是癌细胞在成功到达定植部位之前所要面对的物理、化学和生物挑战[6-7]（图1）。转移级联期间的应激源包括细胞外基质(ECM)僵硬、失巢凋亡（由于细胞与细胞外基质和其他细胞失去接触而诱导的一种特殊的程序化细胞死亡形式）、流体剪切应力、化学和免疫检测[7]，确定转移效率的关键是了解早期转移细胞如何能够抵抗这些挑战并增强其对不同环境的适应性，以及每种类型的压力对最终转移效率的影响程度。
图1转移是一个低效的多步骤易位过程
图注：转移通常发生于原发性肿瘤发展的早期阶段。转移性癌细胞通过上皮-间充质转化（EMT）程序驱动癌细胞从原发部位扩散，以细胞簇的形式侵入临近组织，随后内渗侵入血管。大多数循环癌细胞（CTC）最终由于各种机体压力、免疫系统在循环系统和远端部位死亡。存活的癌细胞在远端器官定植，经过休眠后迅速分裂增殖，在肺、肝、脑和骨等组织中形成大转移。转移是一个极其低效的过程，该过程中肿瘤内微生物可能在多个步骤中发挥作用。
新的研究扩大了我们对转移的认知。例如，研究表明转移发生在肿瘤进展的早期阶段[8-11]，在转移的癌细胞到达远端器官之前，癌细胞甚至可以通过分泌方式远程调控准备转移前生态位（PMN）。当转移细胞开始迁移时，它们通常会集体入侵邻近组织[13]，并作为寡克隆细胞簇在血流中移动，以增强其定植新生态位的能力[14]。这些先驱转移起始细胞改变它们的代谢程序以增强其转移潜能[15-16]，并且在开始分裂之前可以逃避免疫监视并长时间保持休眠状态[17-18]。这些研究使我们增加对转移细胞生存策略的理解，并证实了癌细胞转移能力高度依赖于癌细胞内部细胞特性的观点，例如EMT状态、干细胞可塑性、遗传学、表观遗传学、染色体不稳定性和代谢适应，以及环境因素（机械压力、免疫反应、ECM、PMN和肠道微生物组）[1,19]。
尽管发现这些影响癌细胞转移的因素和方式，但仍不清楚癌细胞获得转移性特征的驱动力是什么？有学者认为癌细胞通过基因变化进化出这些能力[20,21]。然后，癌症进化需要时间，这一观点与转移发生在癌症发展早期阶段相反。此外，即使经过广泛的测序分析，转移特异性基因组改变的证据仍然缺乏[5]。从进化上看，转移性特征不一定有利于初级克隆扩增，有时可能会因肿瘤内克隆间的竞争而不必要的影响。因此，另一种假说提出可传播病原体可能赋予肿瘤细胞的转移特性[22]。实验证明，肿瘤内微生物群是组织的组成部分[23-25]，肿瘤内细菌是不同阶段癌症进展的新参与者，可以从细胞内和细胞外相互作用影响癌细胞转移（图1）。
与快速增长的肠道微生物组在癌症进展中的作用相比，我们对肿瘤内微生物群的理解仍处于起步阶段（表1）。除了结肠、皮肤和口腔外，包括癌症组织在内的人体组织通常被认为是无菌的。癌症生物学最近鉴定了癌症组织中存在微生物群，这些肿瘤组织中常驻细菌被归类为“肿瘤内微生物群”。与肠道菌群可通过代谢产物或与免疫细胞相互作用远程影响肿瘤组织不同，肿瘤内菌群与癌细胞密切接触，因此可能具有不同的功能模式。肠道微生物组在癌症诊断、预后和治疗反应中的作用已被广泛报道[26-28]。因此，本文主要就肿瘤内微生物群的发现、鉴定及其在肿瘤转移过程中的独特功能进行综述。
100多年前WilliamColey发明了科利毒素（化脓性链球菌和粘质沙雷菌的混合物）来治疗一位癌症患者，并观察到肿瘤消退。他假设“每一种恶性肿瘤都可能有外源性或微生物来源”[29]。然而，在这个假设之后的几十年里，没有直接证据表明肿瘤内细菌的存在。到现在，下一代测序技术(NGS）能够使用16S rDNA测序将细菌DNA与肿瘤组织区分开来[30-34]，然而，由于瘤内细菌丰度低和宿主基因组污染严重，从组织处理或试剂中引入的环境噪声信号使数据收集变得复杂，因为它们会掩盖组织的真实微生物概况并削弱结论的稳健性。
这些技术挑战在过去几年已被攻克，多个研究小组报告了大量数据，进一步支持瘤内微生物群的存在。癌症基因组图谱（TCGA）数据库的全基因组和全转录组分析采用了严格的去污流程，揭示了血液和肿瘤组织中癌症类型特异性的微生物特征[24]。此外，生物信息学微生物特征能够区分健康个体和癌症患者。通过对1500多个患者肿瘤样本进行优化的16S rDNA测序，表明不同类型的癌症具有不同的微生物群[23]。值得注意的是，微生物群丰度最高的不是暴露在环境中的组织（如肺癌和黑色素瘤），而是乳腺癌、骨癌和胰腺癌[23]，这表明肿瘤微生物群的丰度是肿瘤特异性的。另一项研究使用小鼠自发肿瘤模型进行16S rDNA测序和细菌培养研究解释了一种低丰度和低多样性的微生物组成与人类乳腺癌相似[25]。这些不同的研究方向为在小鼠和人类肿瘤中检测细菌DNA和活菌提供了证据，并证明了在广泛的癌症类型中活细菌是肿瘤的组成部分（图2）。
图2肿瘤内微生物群是癌症生态系统的组成部分
图注：肿瘤是复杂的生态系统，包括癌细胞、癌症相关的成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。肿瘤内微生物群是各种癌症类型中的一种新的肿瘤成分，肿瘤内细菌同时存在于细胞外和细胞内。肿瘤内微生物群的组成和特征是肿瘤类型特有的。ExTM：细胞外肿瘤微生物群；InTM：细胞内肿瘤微生物群。
如果肿瘤内微生物群存在于广泛的癌症类型中，那么它们来自哪里？从肿瘤组织中分离出的细菌菌株的分析提供了一些见解。在小鼠乳腺肿瘤中，肿瘤内细菌菌株在正常组织中被检测到，表明肿瘤组织从周围组织获得了某些细菌[25]。然而，这些细菌在人体内的主要栖息地是多种多样的，有皮肤上的葡萄球菌（Staphylococcus），口腔中的链球菌（Streptococcus），肠道中的肠球菌（Enterococcus）。鉴于细菌具有在组织间移动的能力，肿瘤内微生物群可能有多个来源[41-42]。鼻咽癌微生物检测实验证实了瘤内细菌主要来源于鼻咽部，小部分来源于口腔和肠道[43]。然而，这些推测需要通过稳定的宏基因组和基因追踪分析加强。
肿瘤内细菌有一些共同的特征：①它们在癌症组织中的丰度远低于肠道中的丰度。定量qPCR和成像定量显示，0.1%-10%的癌细胞携带细菌，不同的定量方法或细菌DNA的提取效率会引起差异[23,25]。②癌症组织中微生物群落的多样性通常低于正常组织中的微生物群落[25]，表明肿瘤可能形成一个独特的环境，选择性地扩展某些细菌种类。③这些细菌是活的，大多是共生生物，主要存在于细胞内[23,25]。癌症组织中独特的细菌栖息地可能使它们与癌细胞存在多向作用模式。
考虑到细胞内和细胞外空间在分子、生化和生物物理方面的巨大差异，与ExTM相比InTM在肿瘤起始、肿瘤进展和免疫相互作用过程中可能具有完全不同的功能。长期以来，细胞内细菌一直被研究为参与病原体-宿主相互作用的致病菌菌株。致病菌通过“触发”或“拉链”模式侵入宿主细胞，并能够迅速破开核内体膜进入细胞质[44-45]。肿瘤内共生细菌是遵循相同的原则还是使用不同的机制来侵入癌细胞？这方面仍知之甚少。在特定的癌症类型中，如乳腺癌，肿瘤内微生物群落主要以革兰氏阳性和兼性厌氧细菌为主[25]，表明肿瘤微环境具有选择效应。不同的肿瘤类型具有不同的血管生成、氧水平、内吞作用以及周围组织中的微生物来源。这些因素共同决定肿瘤内微生物群的组成，并形成肿瘤类型特异性特征。
肠道菌群刺激特定代谢物的产生，调节免疫系统，并重建远端器官的微环境[46-50]。相比之下，专门研究肿瘤内微生物群在癌症转移中作用的研究有限。这个领域的研究还比较浅，缺乏合适的实验工具来准确和特异性地调节肿瘤内的微生物群，同时又不扰乱身体其他部位的共生细菌。这个问题可以通过使用各种抗生素给药方案、使用无菌小鼠和原位细菌再给药解决[25]。越来越多的证据证实，瘤内细菌可以调节癌细胞的内在特性及其外部环境，从而增强癌细胞的能力并为癌症转移铺平道路（图3）。
图3肿瘤内微生物群改变癌细胞的内在特性并重塑转移中的肿瘤微环境
图注：肿瘤内细菌能够在癌细胞内部和TME中发挥功能。对于癌细胞的内在特性，细菌可以调节上皮-间充质转化（EMT）程序、干细胞/可塑性、细胞与内皮细胞的粘附，以及损害循环肿瘤细胞的机械应力；在外部癌症环境中，细菌可以释放促进转移的外泌体，可以打破血管屏障易位到远端器官，建立PMN环境，或者可以调节先天和适应性免疫系统，诱导或抑制免疫反应。
4.1肿瘤内微生物群调节癌细胞的内在特性
为了克服转移过程中的物理、化学和生物学挑战，癌细胞通常会改变其内在程序以应对不利的环境。这些包括干细胞程序/可塑性（用于新位点的肿瘤起始）、EMT程序（用于癌症侵袭和传播）、粘附程序（防止失巢凋亡诱导的细胞死亡）和机械应激反应程序（抵抗机械力诱导的损伤）[1,2,19]。 研究表明，这些程序也可以通过肿瘤内微生物群进行调节。
EMT程序赋予癌细胞具有迁移间充质特征，具有松散的细胞-细胞粘附特性，从而动员癌细胞进行侵袭和传播，这是由TGF β信号通路的激活和与Zeb、Twist和Snail相关的协调转录程序驱动的[51]。多项研究表明，微生物群与EMT之间存在相关性。在人乳腺癌细胞系中，肿瘤宿主脆弱拟杆菌（Bacteroidesfragilis）排泄的毒素诱导了迁移和侵袭性表型，EMT相关的的Slug和Twist表达升高。在位于乳腺导管的肿瘤细胞中，脆弱芽孢杆菌（B.fragilis）定植刺激远端器官转移增强[52]。这种功能调节是否仅限于ExTM，或是否也适用于InTM，以及不同的肿瘤常驻细菌对EMT影响的普遍性仍然是一个需要解决的问题。有证据表明脂多糖（LPS）能够通过TLR-NFκB通路诱导正常人肝内胆道上皮细胞EMT[53,54]。在EMT驱动的小鼠结肠癌模型中，微生物群的存在对肿瘤发展至关重要[55]。这些研究表明存在组织常驻微生物群和EMT计划之间的联系。
癌细胞的可塑性和干性是转移启动的另一个重要因素。研究发现Bacteroidesfragilis毒素可以裂解E-cadherin，触发下游β-catenin核定位，伴随Notch效应子NICD在乳腺癌中的核聚集。在小鼠移植肿瘤模型中，Wnt和Notch信号通路的后续激活，导致干性和肿瘤生长以及转移进展。在自发性MMTV-PyMT乳腺肿瘤模型[具有多瘤病毒中间T抗原(PyMT)的小鼠乳腺肿瘤模型在小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)长末端重复序列下表达]，各种肿瘤驻留细菌物种侵入PyMT癌症细胞触发了乳腺干细胞程序的富集[25]。由于与细菌侵入的癌细胞的体内分离相关的挑战，尚不清楚干细胞程序是否可以在生理细胞环境中被肿瘤内细菌激活。
癌细胞渗入血流引发细胞死亡程序。癌细胞渗入血流伴随着粘附丧失，这通常引发失巢凋亡，或其他形式的细胞凋亡[56]。癌细胞表面粘附分子的表达增强了它们的存活，并防止了转移失败[57-58]。在人类结直肠癌细胞系中，结直肠癌中常见的具核梭杆菌（Fusobacteriumnucleatum）通过上调粘附分子ICAM1显着增强癌细胞对内皮细胞的粘附。这种增强的粘附力使癌细胞能够在尾静脉注射测定中外渗并引发新的转移灶。ICAM1的上调部分是通过细菌依赖性激活Alpk1-NFκB通路实现的[59]。
循环癌细胞受机械应力的影响导致细胞损伤。除了失巢凋亡依赖性细胞死亡外，循环癌细胞还会受到血液中各种机械应力的影响，从而导致细胞损伤，例如流体剪切应力，并在远端器官中导致结构限制[60-62]。这些应激源部分被粘附分子（如整合素）感知，由RhoGTPase信号级联传递，并由Yap/Taz转录因子协调[63]。小鼠肿瘤模型的新发现表明，InTM在侵入宿主癌细胞时会触发流体剪切应力反应，并且这种反应与细菌物种促进转移的能力相关。被细菌侵入的癌细胞可以携带细菌，游走至远端器官，促进癌细胞的存活[25]。这种表型是InTM特有的，因为通过调节RhoAGTPase-Rock-actin细胞骨架重组途径，癌细胞变得更能抵抗机械应力，引发这种反应的细菌机制仍不清楚。然而，从肉毒梭状芽胞杆菌中分离出来并被多种细菌共享的ADP-核糖基转移酶C3胞外酶是一个潜在的候选者，因为C3对细胞是不可渗透的，并且与膜穿透肽融合的C3经常被细胞生物学家用来解离肌动蛋白应力纤维并增强细胞扩散[64]。
4.2肿瘤内微生物群调节癌细胞的外在特性
除了直接调节癌细胞外，瘤内细菌是重要的炎症介质，可以在癌细胞周围形成特定的微环境，从而间接促进癌症转移。
调节PMN的关键因素之一是细菌本身。结直肠癌研究表明，肿瘤驻留细菌能够通过毒力因子VirF调节肠道血管屏障。PV-1表达升高的血管屏障受损，促进细菌从原发性结直肠肿瘤传播到肝脏，并在癌细胞到达之前建立PMN[42]。这种依赖细菌的PMN远程控制是一个新概念，可能对癌症以外的疾病有影响。
肿瘤外泌体可以调节PMN并决定转移器官的趋向性[65]。肿瘤外泌体含有多种功能性脂类、蛋白质、RNA和DNA，释放到细胞外环境中调节靶细胞重塑微环境[66]。源自Fusobacteriumnucleatum侵入人结直肠癌细胞，分离出含有miR-1246/92b-3p/27a-3p和Cxcl16的外泌体[67]。这些外泌体在调节结直肠癌细胞迁移方面发挥作用，并通过靶向GSK3β激活Wnt-β-catenin信号通路显著增加肺转移[67]。这意味着邻近的癌细胞不一定需要被细菌侵入才能转移；相反，它们也可以通过旁分泌外泌体信号来动员以启动转移。
瘤内细菌最显著的特征之一是它们可以被免疫系统识别，从而引发特定的免疫反应。有许多关于肠道菌群失调与异常免疫反应之间关联的报道[68]，但肿瘤内微生物群在调节免疫系统中的作用仍不清楚。一方面，抗生素治疗和细菌再给药实验表明肿瘤内细菌抑制免疫反应。在乳腺癌中，瘤内Fusobacteriumnucleatum以免疫介导的方式加速肿瘤进展和肺转移，瘤内给药Fusobacteriumnucleatum减少浸润的CD4+和CD8+T细胞[69]。在小鼠黑色素瘤癌症模型中，肺组织的抗生素治疗降低了细菌负荷，显示出调节性T细胞减少，T细胞和自然杀伤(NK)细胞活化增强，同时肺转移显著减少[70]。在转基因小鼠肺癌模型中，肺部共生细菌激活了γδT细胞(一种T细胞亚群），通过刺激骨髓来源的IL1β和IL23并引发肿瘤炎症来促进淋巴和骨髓谱系的炎症反应[34]。另一方面，肿瘤内细菌可以触发抗肿瘤免疫。例如，益生菌（鼠李糖乳杆菌：Lactobacillusrhamnosus）的施用强烈促进了针对小鼠黑色素瘤肺转移的肿瘤免疫[70]。此外，瘤内注射双歧杆菌（Bifidobacterium）可刺激STING通路增加树突状细胞数量，并促进基于抗Cd47的免疫治疗[71]。因此，肿瘤内细菌的免疫调节作用是复杂的，并且依赖于环境，并且可能是细菌物种特异性的和或受其细胞内/细胞外居住状态的高度影响。
在癌症患者中90%的患者死于复发和转移。肿瘤内微生物群的作用可以通过具有肿瘤内微生物群信息的癌症患者的生存数据来评估。在胰腺癌患者中，与短期幸存者相比，长期幸存者往往具有更高的微生物群落多样性。此外，肿瘤内微生物群特征（假黄单胞菌:Pseudoxanthomonas；链霉菌:Streptomyces；糖多孢菌:Saccharopolyspora ；克劳氏芽孢杆菌:Bacillusclausii）被确定与生存相关[33]。在其他癌症类型中，尽管样本量有限，但据报道特定的肿瘤内微生物组特征也与转移有关[72-75]。在一项对800多个患者样本进行分析的鼻咽癌临床研究中，肿瘤内细菌载量被确定为一种强有力的预后工具，可以区分恶性进展的风险[43]。这些研究证实了肿瘤内微生物群的预后价值，并支持其在临床肿瘤进展中的作用。
然而，在临床中特异性调节肿瘤内微生物群是具有挑战性的。有一些关于抗生素治疗和癌症风险、癌症反应和生存的回顾性研究，但它们很少专门设计用于剖析肿瘤内微生物群的消除和患者预后。这些广泛的抗生素治疗数据分析报告了癌症发病率的增加和对免疫疗法的一般反应受损[76]。鉴于已经确定肠道微生物组与免疫检查点抑制剂治疗密切相关[77]，目前尚不清楚肠道肿瘤微生物组在调节癌症进展方面是否具有相似或不同的作用。相比之下，一项关于胰腺瘤研究表明，抗生素治疗与晚期转移性胰腺导管腺癌的更好预后相关[78]。鉴于抗生素在效力、吸收效率、细胞渗透性以及给药途径和时间窗的可变性方面存在巨大差异，所有这些变量都可能导致肠道微生物组和细胞内/细胞外肿瘤微生物组概况的根本差异。因此，迫切需要精心定义肿瘤内微生物群调节的临床研究。
综上所述，肿瘤内微生物群是近年来才被发现的肿瘤生态系统的一个组成部分。新兴研究揭示了肿瘤内微生物群在癌症转移的各个步骤中的生物学功能。这些肿瘤内微生物群不仅是肿瘤环境的传感器、肿瘤病理类型、药物反应和预后的指标，而且在功能上也参与肿瘤进展。因此，它们可以作为药物靶点本身或与其他一线治疗方案联合使用。此外，肿瘤内细菌在细胞内和细胞外定位使它们成为肿瘤细胞内和细胞外传递药物的理想载体，逆转细胞间和细胞内的信号网络。Coley毒素在100年前就被试验于治疗癌症，但由于结果不稳定，在临床实践中没有广泛应用。因此，肿瘤中可能有未知因素决定这种治疗疗效。肿瘤内微生物群的发现可能有助于我们重新评估Coley毒素的基本原理，特别是考虑到蛋白质组学揭示的癌细胞可以呈现细菌表位[79]。从基础科学的角度来看，癌细胞比细菌进化得慢。此外，最近的一项研究表明肠道细菌在宿主内进化可导致共生菌成为致病菌[41]。因此，需要进一步的研究来测试肿瘤内细菌促进癌症转移的能力是否源于细菌进化。这或许可以解释不同的细菌种群及其在正常组织和癌组织中的各种功能，以及为什么某些肿瘤类型比其他肿瘤发展得更快。
尽管未来前途光明，但由于缺乏适当的实验工具追踪肿瘤内细菌的时空活动动态，我们对肿瘤内微生物群在恶性肿瘤中的作用的理解仍有限。此外，在一些研究中，肿瘤内微生物群没有明确定义，并且经常与其他微生物混淆。此外，许多研究正在研究肿瘤内微生物群在非生理条件下的功能。鉴于逐渐增加对肿瘤内微生物群的重要性理解，这些限制可能通过先进技术和改进的实验策略克服。未来的研究重点在肿瘤内微生物的起源、细菌与肿瘤细胞之间的串扰以及肿瘤细菌在TME中的功能和生理意义。未来需要解决的具体问题如下：
①什么决定了肿瘤内微生物群的丰度和组成?
②肿瘤内微生物群的起源是什么?
③InTM和ExTM在判断癌细胞内在特性和外部环境方面有什么功能差异?
④怎么才能有效调节肿瘤微生物群的丰度和多样性？
⑤肿瘤内微生物群在癌细胞和免疫系统间的机制研究？
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