肿瘤内微生物还能增强宿主的抗肿瘤作用？ |微生物专题

论文标题：Intratumor Microbiome Analysis Identifies Positive Association Between Megasphaera and Survival of Chinese Patients With Pancreatic Ductal Adenocarcinomas

刊登日期：2022年01月

发表杂志：Frontiers in Immunology

影响因子：7.47

技术手段：16S rDNA测序

（一）研究背景

胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的癌症类型之一，5年生存率约为5%。引起PDAC的因素有吸烟、酒精中毒、慢性或复发性胰腺炎、肥胖和糖尿病。微生物组在PDAC的进展中起着关键作用，肿瘤内微生物组可以通过诱导小鼠先天或适应性免疫抑制促进PDAC的进展；短期PDAC生存者肿瘤切除样本的微生物组与长期幸存者肿瘤切除样本的微生物组存在显著差异，这些微生物部分来自于肠道，形成了肿瘤免疫微环境；长期肿瘤存活者发现的优势菌可能影响肿瘤微环境有助于预后效果。该研究对不同存活患者的微生物群组成进行了研究，为揭示在中国的胰腺癌人群中差异微生物与延长胰腺癌患者的生存期存在关联奠定重要基础。

（二）研究思路

图1 研究思路

（三）研究内容

1.研究队列的特征

表1 临床样本的基线特征

为前瞻性研究微生物组对中国人群PDAC进展的影响，作者收集了PDAC患者的FFPE样本，如表1所示。手术后总生存时间大于600天的患者定义为长期幸存者（LTSs），手术后生存时间在120-300天的患者定义为短期幸存者（STSs），其他患者样本剔除。经统计学分析，LTSs与STSs组在年龄、性别、肿瘤分期等方面无差异（表1）。

2、LTSs和STSs之间肿瘤内微生物群存在显著差异

图2 肿瘤微生物群在LTSs和STSs之间存在差异

通过对LTSs和STSs的FFPE样本进行16S rDNA测序（以下简称16S测序），发现LTSs的Chao1指数高于STSs（图2A），表明LTSs比STSs具有更多样化的瘤内微生物群，同时高微生物量多样性与更好的临床结果相关（与之前的研究一致）；其次，PCoA分析显示LTS患者的样本紧密聚集（图2B-C），表明LTSs样本具有相似的微生物组结构，Bray-Curtis距离差异表明LTS组与STS组具有不同的瘤内微生物组组成，鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、肠球菌（Enterococcus）和巨球型菌（Megasphaera）在LTS样本中显著富集，而只有少数STS样品中含有Sphingomonas（图2D）。因此，LTS和STS患者肿瘤内微生物群的多样性和组成存在明显差异。

图3 差异属和存活分析

作者采用Deseq2、Wilcoxon’s检验和Omnibus进行差异富集分析共鉴定出33个差异富集属，LTS样品中Sphingomonas、Megasphaera、根瘤菌（Bradyrhizobium）、脱硫弧菌（Desulfovibrio）、黄杆菌（Flavobacterium）、栖水菌（Enhydrobacter）和巨单胞菌（Megamonas）丰度较高；而STS样品中狭窄梭菌（Clostridium_sensu stricto 1）、放线菌（Actinomyces）、卟啉单胞菌（Porphyromonas）、凝聚杆菌（Aggregatibacter）和奈瑟菌（Neisseria）丰度较高。为了进一步证实优势菌的存在，作者用针对Sphingmonas和Megasphaera的引物对另外8份LTSs和STSs患者的冷冻肿瘤组织以及癌旁组织样本进行了qPCR分析，结果证实LTSs患者肿瘤组织中Sphingomonas和Megasphaera的丰度高于STS患者（图3B）。此外，肿瘤组织中细菌的相对丰度高于癌旁组织。

为了构建微生物群多样性与患者生存之间的关系，作者根据特定属相对丰度的中值将患者分为两组，结果发现Sphingomonas和Megasphaera相对丰度较高的患者与总生存期显著延长有关（图3C），而其他临床指标如年龄等与差异属无显著相关性。

3、与LTS和STS患者微生物群相关的代谢途径

图4 LTS和STS患者微生物群驱动的代谢途径

微生物群可以通过产生代谢产物来改变肿瘤微环境，作者推测肿瘤微生物可能通过特定的代谢途径增强肿瘤免疫影响患者的预后。KEGG富集分析发现涉及了74个差异通路，LTSs组样品中鞘脂代谢途径富集，可能与Sphingomonas和Enterococcus有关；内质网蛋白加工属于遗传信息处理途径，可能与Sphingomonas和Megasphaera有关（图4）。此外，大多数差异属参与了肿瘤免疫通路，如IL-17和TNF信号通路。因此，肿瘤内微生物组可能通过改变肿瘤微环境来影响患者的生存率。

4、Megasphaera sp.XA511体外刺激不同细胞因子分泌

图5 Megasphaera sp.XA511的SCFA（短链脂肪酸）生成及其对促炎细胞因子产生的影响

细菌种类与PDAC患者的生存有关，但细菌在肿瘤治疗中的直接作用尚未阐明。在本研究中发现Megasphaera富集于LTSs中，并且具有抗肿瘤作用（图3）。有研究表明Megasphaera物种通过产生SCFA增强T淋巴细胞的功能。作者从健康供体的粪便中分离出Megasphaera菌株(称为Megasphaera sp.XA511)，通过GC/MS证实Megasphaera sp.XA511可以产生大量的丁酸、戊酸和异戊酸（图5A）；而在STS中富集的梭状芽胞杆菌（C.ramosum）和肠球菌（Enterococcus）以及拟杆菌（B . thetaotaomicron和B.vulgatus）都只能产生甲酸和乙酸（图5A），表明Megasphaera sp.XA511可能通过产生特定的代谢产物来刺激宿主的免疫系统。

接着将Megasphaera sp. XA511与人巨噬细胞（THP-1）共培养，以评估其免疫调节作用。然后分别用活菌（Megasphaera sp.XA511 LV）、热杀菌（Megasphaera sp.XA511 HK）和分泌上清液（Megasphaera sp.XA511 SN）处理THP-1细胞，测定IL-2、IL-6、IL-10、IFN-g、TNF-a、IL-17A、IL-17F等细胞因子发现以上处理都能促进TNF-a的产生，而活菌诱导的最多（图5B），说明细菌本身和上清液成分都能刺激免疫反应。此外，细菌的上清液和热杀菌都能刺激IL-6的表达水平，但热杀菌而不是上清液可以诱导IL-10产生（图5B），表明Megasphaera sp.XA511 LV可以通过细菌或分泌物的结构成分诱导免疫细胞产生细胞因子。为了进一步验证在其他免疫细胞中的作用，用Megasphaera sp.XA511 LV和Megasphaera sp.XA511 HK与人PBMC共培养，发现只有活菌能刺激TNF-a和IL-6的分泌；Megasphaera sp.XA511 LV和Megasphaera sp.XA511 HK也能极大地促进IL-10的分泌。以上结果表明Megasphaera sp.XA511（活菌或热杀死）细菌都能刺激PBMC中多种促炎细胞因子的产生，与THP-1细胞中的观察结果相似。

5、Megasphaera sp.XA511增强PD-1阻断的体内效果

图6 Megasphaera sp.XA511在体内增强PD-1阻断的有效性

为研究Megasphaera sp.XA511的体内抗肿瘤作用，将构建的小鼠肿瘤模型分别用生理盐水、Megasphaera sp.XA511、PD1抗体（靶向程序性细胞死亡-1蛋白）、Megasphaera sp.XA511联合抗pd1处理，结果发现Megasphaera sp.XA511或PD1抗体单独不能抑制肿瘤生长，但Megasphaera sp.XA511联合抗PD1抗体可显著抑制肿瘤生长（图6A-B），表明细菌分泌的代谢或其他可溶性因子通过PD1途径增强抗肿瘤作用。为进一步探索Megasphaera sp. XA511抑制肿瘤生长的可能机制，作者对小鼠肿瘤组织中的肿瘤浸润淋巴细胞进行了多重免疫荧光染色，发现PD1抗体联合Megasphaera sp.XA511阻断部分样本CD4+辅助T细胞和树突状细胞较PD1抗体或Megasphaera sp.XA511单独组显著增强。综上所述，Megasphaera sp.XA511可能通过影响肿瘤微环境来抑制肿瘤生长，但最终的抑制效果是多种因素平衡作用的结果。

（四）研究总结

该研究通过对不同PDAC患者生存期的FFPE样本进行16S测序，发现不同生存期组中微生物组成存在显著差异，细菌组成的差异与肿瘤微环境中的代谢途径有关；通过体外动物实验，Megasphaera联合PD-1抗体治疗肿瘤小鼠可产生更好的肿瘤抑制效果，表明肿瘤内特异性微生物组可增强宿主的抗肿瘤作用，为进一步阐明肿瘤治疗和预后潜在靶点奠定基础。

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