单细胞多组学专题：胶质母细胞瘤微环境中单细胞和空间图谱
论文标题：T-cell dysfunction in the glioblastoma microenvironment is mediated by myeloid cells releasing interleukin-10
刊登日期：2022年02月
发表杂志：Nature Communications
影响因子：17.694
研究机构：弗莱堡大学医学中心
技术手段：转录组测序、单细胞转录组测序、空间转录组测序
研究背景
胶质母细胞瘤是一种起源于脑部胶质细胞的、颅内常见的恶性肿瘤，胶质母细胞瘤通常发生于成人，其累及大脑的频率高于脊髓。胶质母细胞瘤有时也称为多形性胶质母细胞瘤（GBM）或IV级星形细胞瘤。
由于胶质母细胞瘤诱导表型发生变化后，肿瘤细胞与正常细胞相互作用，促进肿瘤细胞生长，浸润脑组织、抑制免疫反应和诱导血管再生。同时肿瘤细胞还能够改变内皮细胞、神经元等正常脑细胞，形成有利于肿瘤生长的微环境，导致肿瘤细胞快速生长，并对治疗产生抗性。
单细胞转录组：8名诊断为新发胶质母细胞瘤的患者的肿瘤组织样本
空间转录组：3名原发性IDH1/2野生型胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织样本
Bulk 转录组：IL-2刺激下的T细胞系（IL10 / IFN-γ）
01肿瘤相关 T 细胞耗竭与 IL-10 反应相关
该团队对8名诊断为新发胶质母细胞瘤的患者肿瘤组织样本进行了单细胞测序和数据分析（图1），并在CD8+ T细胞簇中鉴定到了效应T细胞程序（CD8 Teff）、效应记忆程序（CD8 TEM）、组织驻留记忆程序（CD8 TRM）等，在CD4+ T细胞簇中鉴定到了效应记忆程序（CD4 TEM）、两个T辅助程序（CD4 Th1、CD4Th17-like）、应激相关簇（CD4 HSP）等（图2a，b）。
为了确定与 T 细胞耗竭相关的转录途径，作者进行了通路信号传导推断，结果发现“S1”状态与 T 细胞耗竭/功能障碍标志物（HAVCR2、CTLA4 和 PDCD1）和来自T耗尽簇的富集细胞的的表达增加有关（图2c）。当沿着从状态S0到状态S1的拟时序轨迹绘制先前定义的耗尽和效应标记的基因表达时，在S1分支的末端观察到耗尽基因表达程序的富集（图2d）。
而拟时序谱系重建后显示Th17-like簇具有独特的亚谱系（CD4 T细胞状态S3和S4），其特征是IL10和TGF-β反应途径的富集增加（图2e，f），揭示了 T 细胞耗竭与 IL-10 以及部分 TGFß 反应之间存在着相关性。
图1 胶质母细胞瘤淋巴细胞的簇和细胞类型分析
图2 T细胞分化的拟时序分析
02IL-10介导的T细胞下游信号传导的扰动模拟
作者通过扰动模拟，用IL-10刺激所产生scRNA-seq数据集富集分析推断常见转录因子结合位点（图3a）。结合以前的研究结论：在ChiP-seq数据中发现基因BLIMP-1和IRF1峰之间密切重叠，IRF1和PRDM1/14结合位点的显著富集，作者在本次scRNA-seq数据中也发现PRDM1在耗尽的CD8簇中的表达增加（图3b），从而提出了“IL10-STAT3-BLIMP-1信号轴可能是肿瘤相关T 细胞耗竭的潜在驱动因素”的假设。为了进一步验证猜想，作者对PRDM1进行了计算机扰动模拟验证，发现胶质瘤母细胞瘤微环境中髓样细胞分泌IL-10驱动诱发T 细胞耗竭（图3c-f）。
图3 T细胞中IL-10反应的扰动模拟
03空间转录组测序确定T细胞的空间分布
为了确定T细胞簇的空间位置信息，以及与特定肿瘤状态的共定位信息，作者收集3名原发性GBM IDH1/2 Wt患者组织样本进行了空间转录组测序。数据集总共包含2352个spot，每个spot中位数为8个细胞（范围：每个spot捕获4~22个细胞）（图4a）。作者通过NMF回归和Moran统计分析，发现CD8+T细胞簇与GBM亚型相关联，肿瘤区域富集为间充质样肿瘤（MES样），星形胶质细胞样（AC样）转录特征与活化的CD8+效应子、CD8+T耗尽簇共定位（图4c，d）。
为了进一步证实这种空间依赖性，作者量化了T细胞和GBM亚型之间的推定距离。MES样和AC样特征富集的spot靠近耗尽的CD8TRM和T耗尽的簇，这表明特定的肿瘤亚型可能与免疫抑制有关（图4e，f）。并发现一种T细胞化学引诱剂和IFN-γ反应以及MES样肿瘤区域中耗竭标志物的表达，证实了CCL2的空间邻近性（图4g）。
此外，鉴于stRNA-seq中缺乏单细胞分辨率，数据集补充了成像质控细胞术（IMC，n = 1），确定了CD8 T细胞群和肿瘤亚组（图4h）。
图4 胶质母细胞瘤中T细胞分布的空间分析
04骨髓-淋巴相互作用的邻域分析
为了研究髓系隔室在多大程度上有助于T细胞的免疫抑制失调，作者引入了“Nearest Functionally Connected Neighbor”算法（NFCN）。该计算机模型用于通过发散（上/下）流信号活动识别最有可能相关的细胞对（图5a）。该算法识别了成对的淋巴和骨髓细胞，及它们相互激活的可能性和每个配体和受体细胞对的最可能位置（图5b-e）。
结果发现肿瘤相关巨噬细胞基因（CD163、CCL4、APOE和HLA-DRA）与CD8耗尽和CD4 Th1 T细胞簇具有较强连接，并观察到参与抗原加工和细胞因子信号传导的途径显著富集（图5f）。对CD163 HMOX1骨髓群体的分析显示IL10的高表达（图5g），在比较顶级连接细胞对的基因表达谱时，观察到CD163和HMOX1的超高表达（图5h，i）。支持物理连接细胞主要来自鉴定的CD163HMOX1髓亚群的观察结果。
进一步研究发现，HMOX1 IBA1小胶质细胞与T细胞非常接近。随后作者使用氯膦酸二钠从模型中化学消耗骨髓细胞，耗竭后，仅剩下极少数量的HMOX1细胞，这表明非髓系HMOX1细胞的比例可以忽略不计，并发现HMOX1 IBA1髓系细胞在肿瘤-T细胞界面的直接邻域（<200μm）中显著富集（图6）。
图5 骨髓-淋巴相互作用的邻域分析
图6 人脑切片中T细胞反应的功能建模
05案例研究：复发性GBM患者的JAK-STAT抑制
在肿瘤切除之前，一名胶质母细胞瘤患者在放疗和CeTeG方案以及TTField治疗后肿瘤复发，然后在芦索替尼的新辅助环境中治疗了4周（图7a）。免疫染色显示CD83和CD726 T细胞显著增加，CD4髓系细胞群保持稳定（图7b，c）。作者将CD8分选细胞的scRNA-seq数据从治疗患者映射回参考数据集后，发现CD4 / CD68平衡明显向CD7细胞转移（图7d）。
相互转化揭示了T细胞群的变化，最大的群体是T效应细胞和T效应记忆细胞，表明JAK抑制支持T细胞活化（图7e）。在代表性不足的CD4细胞群中，向效应器记忆程序的转变甚至更强（图7f）。尽管治疗史显示预后不良，治疗早期复发（7个月），但该疾病在JAK抑制剂治疗后稳定大约8个半月，患者在7个月后仍然存活（图7g）。
图7 胶质母细胞瘤中的JAK-STAT抑制和T细胞反应
总结
本研究中，作者通过scRNA-seq、RNA-seq、stRNA-seq、扰动模拟等手段，发现骨髓和淋巴室之间的功能相互作用导致T细胞功能障碍/衰竭，验证了空间上定位于胶质母细胞瘤（GBM）间充质样亚群中的髓样细胞分泌IL-10驱动T细胞耗竭，导致抑制性免疫微环境，促进肿瘤进展。
最后使用人类新皮质GBM模型和单个患者受试者，我们表明这种IL-10驱动的T细胞衰竭可以通过JAK / STAT抑制来挽救。这些研究成果对于临床治疗胶质母细胞瘤疾病提供了新的治疗方案。
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