One-Step靶向文库制备是怎样炼成的（2）？
极好的文库均一性
由于VariantPro™采用了Relay-PCR™技术，限制特异性引物（OmegaPrimer™）只在最初2个循环——靶标捕获时发挥作用，接着会自动切换到由通用引物主导的文库扩增循环，直到反应结束，从而确保了生成极高均一性的文库（见图3）。
扩增子覆盖的均一性通常是由＞0.2×扩增子平均覆盖度的序列所占百分比来测定。如下图所示，VariantPro™系统制备的人类线粒体DNA文库达到> 99.1%的均一性。
图3 VariantPro™系统制备文库具有极高的文库均一性
极好的重复性
样品和文库制备步骤中的误差是破坏实验重复性的一个潜在来源。这意味着实验越复杂就越可能增加实验误差的几率。
VariantPro™具有极简的工作流程，因而最大限度地降低操作引起的误差。测试实验发现，运行不同的PCR循环数或采用不同的起始DNA量，都不会显著影响测序结果的重复性（见图4，5）。
图4 不同PCR循环次数（15至27个循环）的相关系数分析表明，PCR循环次数不会影响文库组成。
图5 不同的模板gDNA（1.0至10.0 ng）的相关系数分析表明，反应所需模板量是灵活可变的。
更低的支出
VariantPro™系统的高性能（高覆盖均一性和靶标特异性）可以节约测序成本，只需较低的测序深度就能达到所有碱基足够的覆盖度（见图6）。
图6 不同测序深度的相关系数分析（50到1500×）显示扩增子间无显著覆盖差异
极高的灵敏度与特异性
传统的PCR引物设计往往需要在特异性和引物稳定性之间进行权衡。为应对这个挑战，VariantPro™系统采用的Omega Primer™具有三个功能区：5p臂——负责将引物稳定结合到DNA模板上，3p臂——负责检查序列特异性并启动聚合酶延伸，以及环序列——负责分隔两个臂。使用两个独立的结合区段（5p臂和3p臂）给引物设计提供了更多的自由度，平衡了引物特异性和结合强度。Omega Primer™需要5p臂与3p臂同时结合模板，相比于常规引物，这样的设计显著提高了特异性。
为证明VariantPro™系统的灵敏度和特异性以及检测罕见突变的能力，将一个基因型G11778 G＞A（线粒体基因组）的基因组DNA样品混合进野生型基因组DNA样品中，混合比例从0.5%到10%变化。采用线粒体Panel制备的文库用Illumina NGS平台进行测序分析。分析表明，检测到的突变频率十分接近实际的混合频率，表明突变检测灵敏度> 0.5%（见图7）。
图7 检测到的突变频率非常接近实际的混合频率。
胜任降解DNA样本的检测
为展示VariantPro™系统在降解样本上的检测表现，通过加热250 ng HeLa基因组DNA（体系中加入dsDNA Fragmentase）模拟自然降解。模拟降解反应在37℃分别进行0，10，20，30和50 min。VariantPro™实验使用降解的HeLa基因组DNA为模板进行文库制备，并使用Illumina NGS平台进行分析。相关系数分析表明，模板DNA的不同程度降解对VariantPro™实验结果影响极小。不仅如此，VariantPro™系统可以胜任所有类型的临床样本的靶向文库制备要求。
图9 DNA降解对VariantPro™系统的影响。相比于完整的基因组DNA（未片段化），当gDNA模板被消化50 min时，最低的相关系数值高达0.808。
VariantPro™Panel具体参数
*Excluding library clean-up,normalization, and combination
未完待续... ...
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