你不知道的外泌体（2）| 专题

• 如何分离外泌体
  

1 超速离心

        外泌体超速离心一般和蔗糖密度梯度离心或蔗糖衬垫分离低丰度外泌体。虽然超离法因操作简单，但是最多只能同时处理6个样本（转子限制）且回收率不稳定（可能与转子类型有关）；前期需要准备大量材料且外泌体得率低，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。不过将超离和蔗糖梯度离心结合，可以得到高纯度的外泌体，但是此方法比较费时（2天） 。

2 磁珠免疫法

        外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及

3 PEG-based沉淀法

        聚乙二醇（PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。

4 试剂盒提取

       近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒（如SBI出品的外泌体试剂盒），有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。这些试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。

• 如何鉴定分离的外泌体

1 电镜鉴定

       外泌体鉴定最直接的方法是将分离得到的外泌体在电镜下观察。典型的外泌体电镜观察图片如下图：30-100 nm大小的球形或碗形囊泡。

2 Western-blot鉴定

        分离得到外泌体后，可以选择外泌体特异性蛋白做Western-blot鉴定。WB可以选择最多的蛋白一般是和MVBs合成相关的蛋白（Alix、TSG101）及四次跨膜蛋白（CD9, CD63, CD81, CD82），同时WB时能做non exosome marker最好，比如，GRP94, EEA1, Cytochromec, GM130, PMP70, Calreticulin, prohibitin等，这些蛋白都是exosome没有，细胞总蛋白中才有。

• 如何提取外泌体中的RNA

外泌体分离完成后，可以直接提取RNA，可采用如下提取方法：

1 采用SBI试剂盒分离外泌体，然后使用Norgen试剂盒N-51000提取RNA

2 采用SBI试剂盒分离外泌体，然后使用SBI外泌体分离试剂盒配套的RNA提取试剂盒提取外泌体RNA

我们的比较实验发现，策略1提取效果更佳。

致谢技术部刘元瑞提供外泌体资料

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