新医学时代：治疗性基因组编辑
1901年，阿基巴尔德•加罗德爵士鉴定出已知的第一种人体遗传疾病尿黑酸尿症。今天我们认识到，至少有8000种人体疾病是由单个基因突变引起的，称为单基因病，其数目几乎每天都在增加。这些疾病在美国被分类为“罕见病”，因为它们的受累人群都少于20万人，而在全球范围它们则可能累及4亿人口。一些疾病，如镰刀细胞病，在全球累及数千万人口，在世界的特定区域它只能分类为“罕见”，包括美国、欧洲和亚洲的远东地区。对于少数病人，同种异体造血干细胞移植（allo-HSCT）或者实体器官移植可用来治愈其遗传性疾病；对于绝大多数病人来说，没有治疗手段，最多进行一些症状管理。
使用基因组编辑来治疗单基因病从概念上来说是简单的——基因组编辑可以用来纠正致病的基因组“排版印刷”错误。基因组编辑的力量在于，它可以提供一种机制来做比简单修饰单个核苷酸更多的事情。它是一种可以制造更复杂而细微的基因组改变的方法，可以被用来治疗更为常见的疾病或修饰它们的成因。本综述将介绍基因组编辑的基本战略和工具，它们既可以拿来纠正印刷错误也可以对基因组做出更为复杂的改变。然后还将讨论 37 40382 37 14987 0 0 1313 0 0:00:30 0:00:11 0:00:19 2953因组编辑是如何被研发来治疗遗传性疾病、传染性疾病和获得性疾病。最后，简要讨论围绕基因组编辑应用的技术问题：从可能导致工程化遗传改变到可能从一代传到下一代。
基因组编辑以前又称为基因打靶，早已成为科学家手中一种强有力的研究工具。基因打靶在酵母中很容易进行，促使酵母成为研究人体疾病病理生理学的一种重要模式生物体。基因打靶作为一种研究工具，其重要性进一步彰显，在于2007年诺贝尔生理学或医学奖授予了奥利弗•史密斯和马里奥•坎布奇博士，以表彰他们对小鼠胚胎干细胞基因打靶的发展及对小鼠的后续精准遗传工程研究。这是人体病理生理学领域的转折性进步。在基因治疗（研究）的最早期，人们就认识到基因组编辑可以成为治愈遗传疾病的理想方法，但是最早的研究中，通过在人体体细胞内进行同源重组来进行基因纠正的绝对频率低下（10−6），让人们颇感困惑。关键的突破是发现了在靶基因内构建一种位点特异性DNA双链折断（DSB），有可能通过同源重组刺激基因组编辑提升2~5个数量级，提供出5%或更多的总体频率。除了通过同源重组刺激基因打靶可以提高5个数量级，一种位点特异性DSB可能刺激突变，比如引起DSB位点上的微小插入/缺失达9个数量级。正因为如此，DSB被认定为基因组编辑研发中一个关键的原则。
基于核酸酶的基因组编辑基本过程是在基因组内构建一个位点特异性DSB，然后催动细胞自己的内源性修复机制来修复折断（图1）。细胞可以使用两种基本机理来修复折断：非同源性末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）（见表1、图1）。当一个单个折断的编辑因NHEJ而发生，就可以在折断位点上构建出插入/缺失之类的突变（图1a）。缺失的尺寸趋向于大于插入的尺寸，当染色体外DNA在折断位点处被捕捉时例外（其发生率罕见但是可测量），这种时候可以发生数百碱基对（bp）的插入。当使用捐赠者的供体序列进行HR而发生单个折断的编辑时，会发生基因组内的精准核苷酸改变，从单个碱基长度的插入到大型基因盒的导入。当两个折断的编辑通过NHEJ而发生时，染色体缺失、倒转或易位可以得到构建（图1b）。这些总体染色体重排可以有针对性地生成以供治疗用，但是它们还必须得到评价，因为任何核酸酶平台都有产生脱靶效应的潜能。
图1 基于核酸酶的基因组编辑在基因组内构建了一种特异性双链折断（DSB），然后形成一种细胞自己的内源性修复机制来修复这种折断
在证明了DSBs重要性的重要研究论文中，研究人员们使用了一种人工系统，在其内的一种天然归巢核酸内切酶（有时也称为一种“大范围核酸酶”）的靶位点I-SceI被工程化进入了体细胞的基因组内；基因组编辑的频率可以在该工程化的I-SceI位点得到测度。高频率编辑的障碍是，不论是I-SceI还是其他大范围核酸酶都不能轻易地再工程化以识别基因组内的天然靶部位。这个问题的第一种解决方法是已经建立了的锌指核酸酶（ZFNs），最初称为“嵌合体限制酶”，后来被称为“嵌合体核酸酶”。ZFNs是一类人工蛋白质，其一种锌指DNA结合结构域与衍生自IIS型FokI限制性核酸酶的非特异性核酸内切酶结构域发生了融合。首先，在刺激人类体细胞内基因打靶方面，工程化ZFNs被证明了与I-SceI一样有效。然后，因为锌指DNA结合结构域可以被工程化以识别新的靶位点，基于ZFN的方案成为了第一种用来刺激人类体细胞内基因组编辑的方法，其（编辑）频率可达到治疗相关水平。与这项人类体细胞内的研究工作相提并论的重要工作是德纳•卡罗尔（Dana Carroll）及其同事们证明了，ZFNs可以被用来编辑真核生物黑腹果蝇的复杂基因组，使用突变原性NHEJ和同源重组（HR）方法均可。多年以来，硕果仅存的工程化核酸酶，在基因组编辑工具箱内来说是ZFNs和再工程化大范围核酸酶。但是，在过去5年中，TAL效应物核酸酶（TALENs）、CRISPR/Cas9核酸酶和杂交核酸酶平台的研发与构建已经戏剧性地扩展了工程化核酸酶工具箱。
工程化核酸酶平台有六种，四种是基本的、两种是杂交的，它们是：工程化巨核核酸酶、ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9核酸酶、巨大TAL核酸酶和Cas9-FokI核酸酶（表１）。这些核酸酶平台中，彼此之间都有细微的差异，例如，构建起来的折断类型是不同的：大范围核酸酶和巨大TALs生成的是3′突出端的折断； ZFNs 构建的是5′突出端的折断；TALENs构建的折断在位置上是可变的，通常是（但不总是）5′突出端，是由FokI核酸酶（Fn）的性能决定；而CRISPR/Cas9核酸酶构建的是钝的折断。但是，总的来说，这些平台中每一个都可以介导它们的编辑效用，是通过一种DSB的构建实现的，因此它们共享了一种基础性的作用机制。
NHEJ介导的基因组编辑所需要的唯一工具是一种工程化核酸酶，但是同源重组介导的基因组编辑还需要一种工程化的供体性载体。供体性载体可以被设计来使单个碱基对变化发生模板化扩增、或者将大型多基因盒插入到基因组内。核酸酶介导的基因组编辑的同源臂可以比鼠胚胎干细胞内HR介导的基因打靶所要求的同源臂短许多：不再必须有10千碱基对或更长，它们可以短至400碱基对。但是，如果将同源臂进一步缩短至400碱基对以下的话，似乎会减少总体编辑效率。单链寡核苷酸（ssODNs）还曾经被用来催动在导入一种折断后使微小核苷酸改变发生模板化扩增。单链寡核苷酸可以很容易地得到合成，使得这种方法可以相对容易地为研究人员得到和使用，但是，单链寡核苷酸构建基因组内一种靶击性改变的机制并不依赖于经典的同源重组途径，这种事情还没有得到充分的认识。而且，单链寡核苷酸甚至还可以诱导癌细胞内的复制和细胞周期拘留，并且，很可能比原初治疗学相关人体细胞类型更为值得怀疑，这部分地得到了胡班（Hoban）等人的证明。
这个领域内的咒语一直是基因治疗的三个最重要问题：输送、输送、还是输送。基于基因组编辑的工具箱已经扩展开来，这种咒语现在还被用于治疗性基因组编辑的许多问题中：什么是将高活跃性基因组编辑试剂输送进入最为临床相关性细胞类型的最理想程序呢？这个问题的回答正在日益形成疾病特异性。确定恰当的输送战略，最重要的注意事项是，基因组编辑相对于基因增益战略来说，是一种切中肯綮的方法。事实上，核酸酶的持续表达不仅是不需要的，还应该规避：某种核酸酶的连续表达增加了有害基因组不稳定性的机率，既可能使受编辑细胞的适应能力折衷下来，又可以造成已暴露细胞的转化。
对于细胞的体外到体内（ex vivo）操作来说，标准的非病毒性输送方法，如核酸酶之于RNA，或者核糖核蛋白（RNP）之于CRISPR/Cas9系统，似乎是最有希望的方法。输送核酸酶元件如RNA或RNP，保证了既激活I型干扰素应答，又使表达的持续期间最小化。RNA或RNP可以通过一系列机制输送进入一个细胞内，这些机制是由特定细胞类型用不同的复合体转染的能力所决定的。有效穿越所有细胞类型的输送的一种通用方法是电穿孔：使用RNA或RNP将这类细胞混合起来，然后一类简短的电脉冲穿越这些混合物，从而构建起了一些膜孔，让RNP或RNA从中进入膜内。目前，已经有多种不同的电穿孔仪器可资使用，令人惊奇的是，通过这些仪器，可以发现构建最小细胞毒性的电穿孔情形，条件是激活天然免疫系统的DNA或其它核苷酸不被掺合进入混合物中。对于需要核酸酶的简单应用来说，这似乎是一种稳健的解决方案。对于需要同源重组介导之编辑的用途来说，还需要一种DNA分子得到输送。将裸露DNA输送进入癌症细胞株，已经是一种输送供体载体的有效方法，但是将裸露DNA输送进入原初细胞，尤其是T细胞和造血干/祖细胞，会激活一种有害的天然免疫应答，既降低基因组编辑的频率，又危及被编辑细胞的优度。使用腺相关病毒（AAV）将供体模板输送进入细胞，可以是这种问题的一种解决方案，因为AAV与许多病毒一样，已经进化到了可以逃避被天然细胞内免疫应答所识别的程度。
对于要求细胞在体编辑的治疗性应用来说，挑战更为巨大，还没有确定哪怕是一种解决方案。再者说来，在体输送问题的解决方案可能各自不同，取决于需要被鉴定的靶细胞类型。例如，编辑肝细胞的解决方案
将很可能与编辑肌肉的解决方案有非常大的不同，还将可能与编辑中枢神经系统内细胞的解决方案大相径庭。尽管如此，随着具有优先转导不同的在体细胞类型的多种不同AAV病毒血清型的研发，输送mRNAs进入细胞的新方法的研发以及输送特异性组织的纳米颗粒（包括脂质基和非脂质基纳米颗粒）的复杂性日益增加，似乎可以在不久的将来成为一些解决方案。研发一种核酸酶在一种持续性时间期间内不表达的输送方法是重要的，既可以从基因毒性立足点出发，也可以从免疫学立足点出发。这是可以预期的，但必须得到证明，否则，所有的工程化核酸酶平台将被免疫系统察觉为外源，并将引发一种稳健的免疫应答，这种免疫应答可以消除治疗性编辑细胞过度及其导致毒性器官损伤的弊端。
随着治疗性基因组编辑研究走向高潮，数目上与日俱增的创新方法正在得到研发。它们可以沿三种不同的轴向进行分类：非同源性末端连接对同源重组介导基因组编辑轴；体外导入体内（ex vivo）对在体（in vivo）输送轴；遗传性对传染性对非遗传性疾病适用性轴。下面对这些不同的战略略举几例进行讨论。
使用NHEJ介导的基因组编辑可以解决的疾病是那些某种遗传学元件突变引发并可能导致临床利好的疾病，这类遗传学元件到底是一种编码区域、还是一种调控元件、抑或一些其他的遗传元件，值得琢磨。这种方法的一例是：删除造血干/祖细胞（HSPCs）内Bcl11A基因的红系增强子，以便上调γ球蛋白来治疗镰刀细胞病和β地中海贫血。镰刀细胞病和β地中海贫血都是由HBB基因内的突变导致的单基因疾病。如果一种与HBB紧密相关的基因HBG得到上调，从而既可替代丢失的（β地中海贫血）γ球蛋白、又可应对（镰刀细胞病的）γ球蛋白的功能紊乱，则这两种疾病都可以得到治愈。对球蛋白开关的研究已经证明，Bcl11A基因是HBG基因的一种转录阻抑物，这种Bcl11A基因的阻抑可以导致HBG基因的去阻抑。而且，当其被用作一种研究工具时，基因组编辑证明：红系增强子Bcl11A基因内一种特异性调控元件的缺失可以阻抑红系谱系内的Bcl11A基因、但在B细胞谱系内则不能，因而认证了HSPCs细胞内的非同源性末端连接介导的基因组编辑所导致的这种元件之失活是一种治疗学战略。
使用NHEJ介导的基因组编辑的一种不同战略正在得到研发，来治疗杜兴氏肌营养不良，这是一种由肌营养不良基因内突变导致的单基因疾病。在这种在体战略内，一种单个核酸酶可以被输送进入肌纤维，来治疗一种插入/缺失，可以抵消原初性移框突变，从而可以逆转病理性读框突变。或者的话，可以将一对核酸酶输送进入肌纤维、以便删除一套外显子从而删除病理性突变，因此而将杜兴氏肌营养不良转换为较不严重的贝克氏肌营养不良。对于这两种战略来说，概念认证研究都已经得到了发表，但是挑战依旧，那就是达到了肌纤维的一部分、包括心脏和隔膜组织的理想编辑效果，其大小程度足以改变疾病特异性的临床期间。另外，作为一种普遍原理，任何一种可以通过RNA干扰（RNAi）介导的某种基因敲除而治疗的疾病都可以更加确定性地被基因组编辑所治疗。编辑可以导致该基因的永久性敲除，因此将不需要敲除性RNA干扰剂的重复（给药）剂量。
对于传染性疾病来说，从体外导入到体内的NHEJ介导的基因组编辑已经达到了临床II期临床试验，这是一种产生对HIV病毒感染具有耐受性的T细胞群体的方法。这些研究是基于这样的发现：CCR5基因内出现双等位基因突变的人体对HIV病毒感染产生了接近完全的耐受性，而且，使用干细胞内包含CCR5基因内双等位基因突变的供体所进行的同种异体造血干细胞移植，治愈了一位HIV病人。Sangamo生物科学公司和他们的合作者们已经工程化构建了锌指核酸酶（ZFNs）来靶击CCR5基因，然后使用这些ZFNs来突变衍生自已经感染了HIV病毒的病人体内的原初T细胞内的CCR5基因。在I期临床试验中，他们证明了这种方法既是可行的也是安全的，Ⅱ期试验正在进行中。
基于非同源性末端连接（NHEJ）的在体基因组编辑方法还正在在传染性疾病中得到了研发。在多项概念认证研究中，已经工程化构建了核酸酶来识别多种病毒基因组（包括HIV病毒和乙肝病毒的基因组）的关键部件、以便构建将可以用来灭活该病毒的突变。这些研究已经证明：这样的核酸酶可以得到工程化构建，它们可以改变离体模式生物体内的病毒动力学，但是真实的挑战仍然存在，那就是如何在一种在体条件下如何运用这种战略，这种条件要求必须达到向接近所有感染细胞的输送、这种方式并不要求核酸酶的结构性表达。
最后，NHEJ介导的基因组编辑已经被用于了一种概念认证研究中，以作为一种治疗高胆固醇的潜在方法。PCSK9基因是一种胆固醇的调节物，那些PCSK9基因内有罕见纯合性缺乏的病人只是拥有极低的胆固醇水平，在其它方面则是健康的。在体核酸酶介导的基因组编辑已经被用来使肝内PCSK9基因发生突变，结果导致胆固醇水平的下降。尽管这些实验具有多方面的困难之处，它们实实在在地证明了，在原理上来说，在体编辑是如何可以用来治疗多因子性疾病，这些疾病的病程可以使用基因组编辑进行调整、以构建一种临床有用性的基因型。
对特定疾病的病理生理学进行深入认识可以证明，NHEJ介导的基因组编辑是如何可以用来成为这些疾病的治疗方法的。但是，总体上来说，在体外导入体内（ex vivo）和在体（in vivo）两种途径上都具备了同源重组介导的基因组编辑能力后，有潜能影响更大数目的疾病。
使用同种异体造血干细胞移植方法可以治愈多种与人类造血干/祖细胞相关的遗传性疾病，如镰刀细胞性疾病、β地中海贫血、重症联合性免疫缺陷和慢性肉芽肿疾病。在这些类型疾病的同种异体造血干细胞移植应用中，造血系统可以用包含该基因的至少一种野生型版本的细胞来替代，由于该原因，一些此类方法已经被称为“同种异体基因疗法”。由于HR介导的基因组编辑方法的使用，可以用遗传学纠正的自体细胞来替代遗传学纠正的同种异体干细胞。要做到此，既可以直接纠正缺陷基因，也可以使用同源重组介导的基因组编辑来将治疗性转基因靶向到一种“安全的避难所”，在这种基因组位点上，转基因可以在需要的水平上表达、并且不会导致被修饰细胞的功能紊乱或转化。用同源重组进行的基因纠正有一个潜在的问题，那就是除镰刀细胞性疾病外的许多遗传性疾病可以由遍布该基因的突变所引发。在可能考虑为每个单个突变设计核酸酶的的工具中，工程化核酸酶工具箱就是这样的一个。但是，一种替代的方法是设计供体载体，在这种情况下，在同源重组之后，整合性转基因可以功能性地纠正所有的（或者大多数）致病性突变。使用这种战略，一种单个的组合试剂可以研发来治疗所有的遗传病个体，这种战略可以显著性地简化研发和管理过程。
对于在体同源重组基因组编辑来说，概念认证研究已经得到了描述：不仅致病的突变本基因可以得到直接的纠正，而且可以将某种转基因整合进入一个特定的位点，使之可以在足够解救致病缺陷的水平上得到表达。在直接基因纠正战略中，核酸酶和供体载体被输送到了延胡索酰乙酰乙酸酶（FAH）缺陷小鼠体内。正常说来，FAH缺陷导致了肝细胞死亡，但是，在基因组编辑机制得到输送后，小量的肝细胞得到了纠正。这些被纠正了的肝细胞在其它存活肝内再次生长繁殖，从而解救了小鼠不出现肝衰竭。在这些实验中，被纠正的细胞相对于未纠正的细胞来说有一种巨大的选择优势，这种选择优势的原理是一种被基因治疗学术界所常规使用的原理。在转基因靶击战略中，核酸酶被用来刺激某种治疗性转基因（IX因子或溶酶体贮存酶类）的靶向性导入进入某个基因座，可以驱动肝细胞的高水平表达。在这种方法中，小量的被修饰肝细胞能够在一种系统化水平上解救致病性遗传学缺陷。
从体外导入到体内的同源重组基因组编辑还正在被用来研发，作为治疗HIV病毒耐性的免疫系统的一种方法。HIV病毒的一种特性是它的突变和逃避任何抑制的能力，因此有可能的是，简单地突变CCR5共同受体将不足以给予HIV病毒的细胞耐性。而且，许多HIV病毒感染病人已经构建了HIV变异本，通过CXCR4共同受体进入细胞，因此可能逃避任何只靶向CCR5基因的方法；但是，通过使用同源重组介导的编辑，可以在插入一个抗HIV病毒基因盒的同时灭活CCR5基因，因此而构建起针对HIV病毒生命周期的多个遗传学阻抑物、并且抑制了通过CXCR4共同受体进入的变异本。
最后，从体外导入到体内的同源重组介导的基因组编辑已经在概念认证实验中得到了证明，是某种获得性疾病的治疗学方法。在这些实验中，通过同源重组工程化构建了成纤维细胞来分泌某种创伤愈合生长因子。当这些工程化成纤维细胞被植入到小鼠创口时，它们通过刺激血管形成而加速了创口的愈合。从原理上来说，这证明了通过工程化构建，使得细胞分泌出可以解救非遗传性疾病的治疗用蛋白。这可以用于人体的创口愈合，但是人们还是可能推测，例如，某种类似的方法可以用来工程化细胞构建，不论是体外导入到体内、还是在体，都可以分泌神经保护因子来减缓或中止神经退行性变、或者促进创伤后的神经形成或神经再生。
与其他永久改变细胞基因组的方法相比，基因组编辑的巨大潜在优势之一是其过程的特异性。而且，通过某种位点特异性工程化核酸酶而导入某种双链折断（DSB）是基因编辑的关键问题，众所周知的是，双链折断可以产生基因组学不稳定性，包括染色体易位、染色体丢失和非整倍性。因此，核酸酶介导的基因组编辑临床研发的一个关键问题是，建立一系列试验来评估该过程的潜在安全性。不幸的是，这个领域还很年轻，还没有任何单个的或成套的试验已经被认证了可以建立起对人体来说将是安全的编辑过程。相反，安全性和毒理学分析的评估是根据以下原理进行的：1)使脱靶双链折断及其可能产生的插入/缺失最小化或得到消除；2)使用最佳可得模型来评估被编辑细胞的功能性行为；3)将基因组编辑过程放入到在每个人体内连续不断地发生的天然基因组学不稳定性的背景中去。这些基础性的标准可以适用于任何被使用的核酸酶平台，因为每个平台都是通过某种双链折断的构建来运作的。
评估某种核酸酶的特异性既有偏倚性方法也有非偏倚性方法。生物信息学工具的基本原理是搜索拥有与意图的靶位点相似的序列的位点，这可以有助于预测哪些脱靶位点应该得到检查。一旦一套位点得到了鉴定，就可以应用深度测序来审查那些位点，以便确定在那些位点上是否存在核酸酶产生的插入/缺失。基于深度测序方法学目前的错误率，某种给定位点的检测限度是~0.01%（或者万分之一）。而且，生物信息学算法仍然处于它们的早期研发阶段，还不能可靠地鉴定所有潜在的脱靶位点。为了使用生物信息学来对偏倚性方法进行补充，人们新研发了非偏倚性工具，包括折断指导性测序、HTGTS、BLESS和Digenome-seq方法。其它试验使用染色体外DNA，包括腺相关病毒、裸露DNA质粒和整合缺陷性轮状病毒载体，来捕捉折断，有助于评估某种核酸酶的特异性。这些工具拥有特定的效力，因为它们还可以鉴定规模性染色体重排（如易位），后者使用偏倚性方法是不能得到鉴定的。由于染色体易位将是一种罕见但是不可避免的诱导性双链折断的结果，它的严谨操作可以避免靶向那些在治疗性基因组编辑研发的此阶段中癌症关联性染色体易位所涉及的那些基因。
这些无偏倚方法的挑战是，它们已经在特异性癌症细胞株内得到了研发，这些细胞株并没有完整的DNA修复通路，它们需要适应于拥有完整DNA修复通路的原初临床相关性细胞类型。而且，这些工具还提供了对优化某种核酸酶的特异性有用的信息。例如，如果这些试验揭示了核酸酶拥有多个脱靶位点，则它们提示核酸酶应该得到再设计，以达到更加具有特异性。对于锌指核酸酶来说，这可能需要使用核酸酶结构域中强迫性异二聚体结构，或者探索氨基酸内的特异性改变，来调整对靶序列的识别。对于TAL效应物核酸酶来说，这可能需要使用核酸酶结构域中强迫性异二聚体结构，或者使用TAL效应物识别结构域内的替代性重复可变性双残基（RVDs）。对于CRISPR/Cas9核酸酶来说，改善设计可能需要检验某种不同的指导序列，或者使用某种截断顶端的指导序列或配对切割酶方法。对于所有这些平台来说，可以通过限制核酸酶表达期间来增加特异性，这种期间是减少核酸酶暴露的AUC值（曲线下面积）的药理学等价物。
对于直接鉴定核酸酶的潜在脱靶位点的意图来说，一种补充方法是通过一种更为经典的功能性药理学－毒理学方法来评估基因组编辑过程。这种战略评估的是，基因组编辑过程是否会构建出不能执行它们正常功能（例如造血干细胞重构多谱系血细胞生成的能力）并转化成为癌症细胞的细胞，或者是否会导致群体变得克隆斜交（一种可能的预兆，细胞的构建可能在某种时间框架后得到转化，不仅仅可以用目前的试验来测度）。
偏倚性、非偏倚性和功能性方法需要在受研的治疗性细胞类型内得到执行，使用的是规划好的临床级别基因组编辑过程，因为在其它细胞类型内的评估，尤其是已经转化了的癌症细胞株的评估，可能是不相关的。
应该记住的一个重要原理是分裂中的细胞正在形成了持续性的基因组学挑战（激发）。据估计，每次当细胞分裂的时候，它必须修复20-40个DNA双链折断，不用考虑数百万个其它类型的DNA病灶。这种天然基因组学挑战的结果是一个正常分裂干细胞在每次细胞分裂中获得了接近3-30个突变。据估计在每个个体内每秒发生了一百万个突变。有人已经提出，通过病人衍生的诱导多潜能细胞的基因组编辑而进行的基因纠正，然后进行全基因组测序来确定是否已经发生了有害突变，可能是一种更为安全的方法。从体外到体内扩展所导致的突变负荷，从一个单个细胞到治疗相关性细胞数目（对于造血系统疾病来说，根据病人细胞大小的不同，而介于50-800百万个细胞的数量级），可能事实上更为原癌基因性，相对于只修饰巨大数量的体细胞、而不能对任何一个细胞的基因组进行测序来说是这样。
强有力基因组编辑工具箱的研发，并将这种工具箱用来通过受精卵注射构建多种多样的遗传修饰物种，已经提高这样的可能性：一些人可能使用人体受精卵内的基因组编辑来构建人体。这种可能性得到了一些中国研究人员工作的彰显，他们在三原核人体受精卵内使用了这种方法，这类人体受精卵在遗传学上来说不能在人体内得到研发，但是在概念上接近于与二倍体受精卵相一致。三原核受精卵注射实验闪亮提示了这种过程的低效率和不可预测性，这些发现得到了使用健康二倍体受精卵的动物实验的预测。这些结果清楚地证明，如同受精卵注射之类的基因组编辑技术应用，尽管从伦理学判决上来说是可允许的或令人满意的，还不足以进入人体应用。而且，这些特异性实验和总体概念已经产生了大量的专业或非专业的文献报道。在发展方向上来说仍有许多问题需要加以确定，但是就前沿研究工作来说，我希望提出自己的几项原则：首先，伦理学问题不应该阻碍强有力基因组编辑工具在研究中的运用，这种运用为胚系细胞、胚系细胞研发和早期胚胎发育提供了更好的认识。其次，应该听取来自不同领域的科学思想领军人物们的讨论，还要考虑来自不同的利益相关者们的意见，尤其包括那些发生了多个世代的致命性遗传病家系的意见。第三，目前还没有单个的伦理学观点形成优势观点，理想的结果是，新的认识和观点可以整合进入一种持续、反复的过程，而不仅仅是形成一种在单个时间点上的清晰分辨率。最后，使用基因组编辑的问题可能导致特异性基因型传播到未来世代，需要放在这些活性的背景下加以考虑，它们已经发生，类似地影响到了未来世代的基因型结构。两项这样的例子是选择性受精卵植入中的植入前遗传学诊断，和治愈或帮助遗传疾病病人（一种明确的好事），使得他们不将他们的致病突变遗传给他们的儿孙们。
基因组编辑的精准性和纠正DNA序列内致病性基因组信息错误的能力，已经使得这个领域在概念上吸引了人们的关注和兴趣。人们激动地预测，在接下来的十年中，将会有数十项（或许还不止）基因组编辑临床试验得到来自学术界、生物科技创新公司和药企的研发。但是，还有一些重大问题未能得到解决。
➤包括建立适合于基本技术的管理框架；
➤建立安全有效的机理；
➤建立灵活的、适应性强的管理框架，这种框架需要考虑受到这个问题影响的多种多样利益相关者集团的诉求，还必须尊重目前不同的发展理念和发展文化。
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