【精华回顾】郑利民教授分享肝癌组织PD-L1的表达、调控与临床意义

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作者：竹子

导言：6月22日，中国医师协会临床精准医疗专业委员会和转化医学网举办了精准医学新发展系列在线直播研讨会第四场，共有四位专家在线分享了个体化精准医疗之肿瘤的免疫和基因疗法。以下是小编对第一位专家郑利民教授的授课内容进行的重点内容整理。

郑利民 教授

博士生导师

 中山大学教授

国务院学位委员会学科评议组成员

荷兰Leiden大学博士，1999年被瑞典国家研究院聘为助理教授。2002年回国，先后获国家杰青和教育部长江学者。曾任中山大学生命科学院院长和肿瘤医院生物治疗中心主任；现任中山大学教授，国务院学位委员会学科评议组成员。

多年来一直从事人免疫细胞研究，在国际期刊发表论文100余篇。回国后，以肝癌为主要模型，探讨人体肿瘤组织中免疫细胞与癌细胞之间的相互作用、调控机制及其临床意义。先后主持了国家科技重大专项（首席科学家）以及5项国家基金委重点项目。近年作为通讯作者的论文发表在PNAS、JCI、JEM和Hepatology等刊物。作为第一完成人获“国家自然科学二等奖”。2015年起，连续六年入选Elsevier 发布的“中国高被引学者（医学组）”榜单。

郑教授为大家分享了他们实验室的工作，主要讲肝癌组织PD-L1的表达、调控与临床意义。

肿瘤是地上的一个种子在合适的土壤中生长出的结果。以前做总结时，很多人主要关注癌细胞本身，实际上，肿瘤=癌细胞+适宜组织微环境。像中国人讲的南橘北枳一样，就是说橘子跟北枳这两个东西，其实是一模一样的，但因为在不同的气候和土壤环境下，就展现出了不同的这个表型。所以最近一项由Hanahan& Weinberg领导的一项研究中提到，如果要真正了解肿瘤生物学，就必须要结合微生物环境来开展研究。该研究发表在Cell上。

免疫细胞是微环境的重要组成部分。在正常组织中，每天基本都会有些细胞发生突变，或者恶变的细胞出来，这种情况下免疫细胞是起抗肿瘤的作用。在很多实体瘤中，通过临床数据的分析可以发现免疫细胞反而起着促肿瘤的作用。

因为免疫细胞同时具有抗肿瘤和促肿瘤的双向作用，所以恢复或重建组织微环境的抗肿瘤功能，可以作为肿瘤治疗的新策略。

在肿瘤免疫这一块，以往大家都在想单纯提高抗肿瘤免疫，比如回收或激活免疫细胞，总体效果都不是非常理想。最近前几年，美国免疫学家詹姆斯·艾利森（James P Alison）和日本免疫学家本庶佑（Tasuku Honjo）因为在肿瘤免疫领域做出的贡献，荣获 2018 年诺贝尔生理学或医学奖。其实主要是提出一个概念：正常组织中本来是具有抗肿瘤的功能，那是否能恢复或重建它的抗肿瘤功能？他们提出的概念让治愈癌症成为现实。他们发现，在肿瘤中，促肿瘤作用里抑制免疫的有两个很重要的分子，即“刹车”分子PD-1和CDLA4。

詹姆斯·艾利森（James P Alison）（左）

本庶佑（Tasuku Honjo）（右）

在肿瘤治疗方面，现在已经有不少公司在做免疫检查点的药物了，用的最多的就是“明星”分子PD-1。实际上用了PD-1药物后，临床上确实已经起到了一个革命性的改变。但真正的效果是不是用了这个药物后，所有病人都能好的？实际并不是。

目前PD-1/PD-L1只对一小部分患者是有效的。比如，在肝癌病人里，17年有一个国际多中心的临床试验，发现晚期肝癌中，PD-1抗体单药大概可以获得20%的临床缓解率，延长患者总生存。

但真正完全缓解的，其实远远低于这个数字，于是就提出了一些问题：

·为什么只有部分病人有效？-新的机制？新靶标？

·哪些是适合病人？-判断模型？知道个体化治疗

·能否提升疗效？-传统治疗方案（改良与联合）

关于PD-1、PD-L1抗体治疗对于哪些病人有效果，目前临床上没有一个真正的特别有效的标记物。现在有多个临床实验的证据提示，如果肿瘤组织中，浸润免疫细胞，特别是髓系APC上，表达PD-L1的病人与PD-1/PD-L1治疗应答相关。

免疫细胞：在外周血和组织中呈现出不同的表型

很多人大概都在做外周血和淋巴结等，但实际上，真正发病的地方，或者说是免疫细胞“打仗”的地方，可以看到外周血跟组织中免疫细胞的表型是不一样的。这也提示一点，如果将来发展一些标记物，临床组织里出来的结果可能更加可靠，更能反映实际情况。

免疫微环境：认识初级阶段，对人肿瘤了解更少

另外，一般在动物实验或体外实验中，经常可以看到有一些药物或治疗方案对抗肿瘤能达到完全缓解。实际上在临床上面很少，为什么呢？主要是人的实体瘤跟动物实验里面差别非常大。除了免疫细胞，或者是除了细胞的种类不一样以外，另外有个很重要的一点，就是小鼠的肿瘤大部分都很快形成，而人的实体瘤，是免疫系统与癌细胞长期共进化的一个结果，都处在不同的区域。

免疫细胞在肝癌组织中的选择性分布特征

郑教授的实验室一开始做免疫细胞在肝组织中的分布，发现组织中的免疫细胞不是随机分布的。

Mφ在肝癌组织不同区域的独特表型与功能

其实同样一个类型的细胞在不同的区域也是不一样的。

一个肝癌组织的连续的切片

郑教授等以前就在做了，发现Mφ多由外周血单核细胞迁移和分化而成。那么就提出疑问：肿瘤微环境如何调控Mφ表型？不同表型Mφ对预后影响如何？

得出结论：肝癌组织中，癌巢和间质中的Mφ数量均与预后成负相关

他们还发现：活化细胞数量越多，转移复发率就高。

这里就会有一个问题，活化的免疫细胞如何促进肿瘤进展？

在肝癌组织侵袭边缘的单核细胞高表达PD-L1（B7-H1）

郑教授等大概在十几年前，就当时就做了PD-L1表达在组织中，现在他们发现在肝癌组织里的癌巢区域，PD-L1主要表达在单核细胞上。

现在一些年轻的临床医做实验的仪器的话都是很灵敏的，很弱的信号都能检测出来，但分子或者细胞在组织上的表达是有差异的，所以一开始可能是用一个比较低的电压来给做曝光，然后他另外有个片子就是检测比较弱的信号的。

如果报告时间很长，里外差别是看不出来的。这说明单核细胞在肝癌组织中是表达最主要的一类。

结论：

➢ 单核细胞：在肿瘤中  表达PD-L1 分子，外周血不表

 达，说明受到肿瘤微环境的调节。

➢PD-L1 的表达程度与患者肿瘤进展正相关。

➢PD-L1 主要分布在癌旁间质区域。

那么为什么只有癌旁间质的单核- 巨噬细胞高表达PD-L1 分子？据此，郑教授等做了一个奇怪的试验。结果发现：活化早期的单核细胞表达PD-L1；PD-L1受单核细胞自分泌因子的调控；IL-10起主导作用，TNF-α协同。

肿瘤组织中的T 细胞高表达 PD-1 (PD-L1 受体)

 介导了活化单核细胞的免疫抑制作用

那么大家可能就在想肿瘤组织中表达PD-L1的话，它里面的免疫应答有什么影响呢？郑教授发现，PD-L1介导了单核细胞的免疫抑制作用。

肿瘤活化的单核细胞表达 PD-L1 诱导免疫逃逸

在体内，如果阻断单核细胞上面的PD-L1的表达，就会恢复单核细胞抗肿瘤的活性。

活化单核细胞通过诱导Th17/Th22 分化促进血管生成

那么同时那为什么还有其他的机制？还有没有促进调控肿瘤的进展呢？他们发现，活化单核细胞还是可以通过调控Th17、Th22的分化来促进血管生成。

第一部分小结：

组织特定区域  炎症反应促进肝癌进展的新机制

——将活化单核细胞“ 铸剑 ( 抗肿瘤免疫) 为犁 ( 血管生成) ”

肿瘤组织：单核/ 巨噬细胞表达 PD-L1 ， 促肿瘤;

 可预测患者对anti-PD-1 mAb 治疗的应答

根据前面的结果，大家可能会想，在肿瘤组织中，单核、巨噬细胞表达PD-L1，可以促肿瘤，有助于疾病的进展。但实际上，最早提到单核、巨噬细胞表达PD-L1时，是可以预测病人对PD-L1抗体治疗的应答。意思就是，在肿瘤组织中，它表达PD-L1的分子时，尽管这个分子是不好的，但其实这些病人进行治疗后效果是比较好的。那为什么这个分子不好病人治疗还好呢？其实根据上面的结果，可以知道为什么免疫细胞会表达PD-L1，说明这个免疫细胞是一个活化的。意思就是，如果在肿瘤组织中，看到单核细胞、巨噬细胞表达PD-L1，这说明这个组织实际上具有抗肿瘤潜能。所以，如果阻断PD-L1，就有可能恢复其抗肿瘤性。

举个例子，PD-1和PD-L1都是“刹车”分子。如果说你去看两辆车，有一辆车刹车不好，还有一辆车子刹车非常强。那可以推测出来哪一辆车的发动机比较好，如果要修车，肯定是去修刹车比较强的那台。因为这个车要这么强的刹车就说明这个车的发动机是非常有利的。如果把它的刹车修好了，那它的启动就会非常快；如果车连刹车都没有，那可以推断出车可能修后发动机也不行。

于是，当时郑教授等与上海中山医院肝癌研究所等一起做了450余例的PD-L1在肝癌癌巢中的表达。他们发现，PD-L1样本病例中，大概有将近30%的病例是阳性的。在70%的病人里，巨噬细胞和肿瘤细胞都不表达PD-L1。他们还发现，同样一个免疫分子表达不同类型细胞上，它对于愈合状态是不同的影响。同时，他们也做了多重荧光染色，发现免疫细胞PD-L1的表达是在单核/巨噬细胞上面的。

大家自然就会想，单核/巨噬细胞的组织环境是什么样呢？巨噬细胞上高表达 PD-L1 -- 活化的组织微环境，巨噬细胞上高表达 PD-L1:  组织高表达多种肿瘤抗原。

这给大家一个提示：

肿瘤治疗的新思路——联合治疗

如果将来做肿瘤治疗，这可能提供一个新的思路。热肿瘤是具有免疫原性的，里面很多免疫活化的细胞，这些病人给他们用PD-1/PD-L1进行治疗，可能会有相对好的效果。但在临床上，这其实占很少，绝大部分病人实际上没有免疫原性。因为肿瘤经过人身体里跟免疫系统长期得共进化后，就没有了免疫原性。那怎么办呢？如果结合其他的治疗，比如在里面用溶瘤病毒，有射频的消融，或者用其他的一些治疗方案，也要用到局部产生炎症反应里面，就有可能营造一个相对活化的免疫环境，然后再进行治疗，就会有一个比较好的效果。

那么肿瘤细胞表达PD-L1是怎样调控的呢？如果在肿瘤组织中，主要高表达EZH2，它能负调控IFN-γ诱导的PD-L1表达在肝癌细胞上。在很多阳性病例中，很多不表达EZH2。

肝癌肿瘤细胞中EZH2 调控PD-L1 表达模式图

那么单核细胞为什么会高表达PD-L1？免疫细胞的活性是受到所处的环境的调控，于是郑教授等就去观察了正常组织中营养缺乏的环境里的糖酵解，发现肿瘤相关单核细胞的有氧糖酵解效应显著提高。如果在其中使用糖酵解抑制剂时，就会明显抑制PD-L1的表达。在其他的系统里，糖酵解并非通过PKM2-HIF1α调控TAM 表达PD-L1，糖酵解通过PFKFB3 调控TAM 表达PD-L1，PFKFB3 调控PD-L1 表达并与效应T 细胞功能显著相关。

总结

肝癌组织中PD-L1 的表达:

1.  不同区域 -  独特的分布；不同细胞— 独特功能。

2.  免疫细胞：PD-L1 主要表达在活化 的单核/ 巨噬细胞上 ；

 伴随活化的肿瘤微环境；具有回复抗肿瘤免疫应答的

 潜能 ( 通过阻断PD-1/PD-L1)

3.  肿瘤细胞：主要受IFNγ 诱导，EZH2 可通过调节PD-

L1 和IRF-1 启动子的H3K27me3 水平来调控PD-L1 表达。

4.  思考：如何更好/ 合理的调控免疫应答— 新的治疗策略？

 （包括联合 EZH2 抑制剂以及代谢调控分子等）

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