Cell Reports:定量蛋白表达谱揭示神经元分化的动态变化过程
景杰编者按：神经元的分化包括轴突或树突的产生、突触的形成等诸多阶段。近日，荷兰乌得勒支大学研究人员利用同位素二甲基标记结合LC-MS/MS技术，系统性的分析了神经元分化过程中蛋白质表达的动态变化过程，发现大量蛋白表达差异超过2倍，表明在分化中神经元蛋白存在广泛的重塑现象。另外，研究人员发现神经细胞粘附因子能通过促进肌动蛋白丝的生长来刺激树突发育。这一研究近日发表在Cell Reports上。景杰生物作为全球蛋白质及蛋白质修饰领域的领跑者，可以为您提供从组学筛选到抗体定制的全套解决方案，为您的科研助一臂之力。
神经元细胞实现体外培养成为研究神经系统发育及功能的重要基础。早期的研究主要集中在转录水平检测啮齿动物神经细胞发育过程中基因表达的变化。研究显示在海马神经系统发育的不同阶段，mRNA的表达情况大不相同。另外，原代培养海马细胞的轴突特化过程与树突特化过程相比，基因的表达水平也相差甚远。而近些年，非编码RNA的表达在神经发育研究中也越来越多地受到学者的重视。此外，有学者将不同大脑区域和不同细胞类型包括大脑皮层神经元的转录组与大规模定量蛋白质组分析进行关联比较，发现在相当多情况下，由转录组测得的基因表达变化并不能完全反映蛋白水平的变化。两者之所以关联性较差可能的原因包括蛋白质转换、半衰期、翻译后修饰等。因此作者认为，利用先进的高通量定量蛋白组学手段能更确切地解释蛋白质的表达情况。在本篇文章中，作者以体外培养的神经细胞作为研究对象，比较不同神经细胞发育阶段蛋白质的动态变化。
图1
收集轴突生成特化（DIV1）、树突产生（DIV5）、突触形成及成熟（DIV14）三个阶段的神经细胞，结合稳定同位素二甲基标记与LC-MS/MS技术，共鉴定到6753个蛋白，其中三个阶段都有定量值的蛋白达4354个，其中1793个蛋白的差异变化超过2倍（图1）。差异蛋白模糊聚类分析显示，参与细胞周期和DNA复制的蛋白例如DNA解旋酶等在早期神经细胞分化过程中表达逐步下调，与RNA代谢相关的蛋白、转录因子如Sox11等在DIV5到DIV14阶段表达下调。而一些参与多糖、氨基酸、脂质代谢的蛋白在DIV5到DIV14阶段表达上调，与细胞粘附、细胞间信号传递相关的蛋白如Egfr、Ntrk3等在DIV1到DIV5阶段表达持续上调（图2）。
图2
在神经发育过程中，细胞粘附因子起着至关重要的调控作用，能介导轴突定向及轴突-树突接触的形成，进一步调节树突刺形态和突触可塑性。在本研究鉴定到的细胞粘附因子中有24个蛋白在树突形成中表达上调，其中神经细胞粘附因子1（NCAM1）表现尤为突出。NCAM1基因由于可变剪切可产生3种亚型，NCAM140和NCAM180属跨膜蛋白，NCAM120是糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，其中NCAM180是神经细胞中存在的最主要的亚型。本研究中观察到，NCAM1在树突生长锥中高度富集，到神经元发育后期，NCAM1广泛散布于树突质膜之上。另外，NCAM180敲除细胞株显示，NCAM180基因缺失后，轴突及树突的延伸受到明显的削弱。下一步，作者进一步探明NCAM180影响树突发育的具体机制。
图3
作者在HEK293细胞中瞬时表达GFP-NCAM1，分离出GFP-NCAM1蛋白再与年幼/老年小鼠脑提取物共孵育，IP下NCAM1互作的蛋白。有趣的现象是，一些与肌动蛋白结合、稳定或者聚合相关的蛋白如血影蛋白（Spt）、肌球蛋白（Myo/Myh），原肌球蛋白（Tpms），F-actin加帽蛋白（Capzas）和辅肌动蛋白（Actn）是NCAM1主要的互作蛋白，在年幼小鼠脑提取物中广泛存在，而在老年小鼠脑提取物中含量有所减少。为研究NCAM1与肌动蛋白细胞骨架之间的关联，作者用jasplakinolide处理NCAM1缺失细胞株以观察树突的表型。Jasplakinolide是一种药物能够稳定肌动蛋白纤维并且促进肌动蛋白聚合。结果发现Jasplakinolide的添加能部分回复由于NCAM1缺失引起的神经细胞发育缺失，树突干及尖端树突的长度都有显著的增长。由此，综合以上数据表明，NCAM1可以通过调节肌动蛋白稳定性来调控树突的生长。
本研究综合同位素标记及LC-MS/MS技术获得的高通量蛋白质组学数据，为神经细胞发育的研究提供了基础数据库。随着质谱技术的不断发展，TMT或iTRAQ标记试剂的应用使得可比较的实验组数进一步扩大，相信未来会有更加推陈出新的研究继续深化神经系统蛋白质的动态变化机制。
Frese C K, Mikhaylova M, Stucchi R, et al. Quantitative map of proteome dynamics during neuronal differentiation. Cell Reports, 2017, 18(6): 1527-1542.