见微知着---蛋白质磷酸化组学揭示两类白血病分子机制的差异

景杰编者按：白血病是危害人类健康的重要杀手，而其机制的解析一直是人们研究的热点。白血病的产生和BCR、ABL基因发生易位，产生BCR-ABL融合蛋白有关。该融合蛋白分为两种亚型：p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL，尽管这两种亚型密切相关，但他们所导致的临床症状确截然不同。前者导致急性骨髓性白血病（ALL），而后者导致慢性粒细胞白血病（CML）。为了研究这两种亚型之间的区别，约翰霍普金斯大学的研究者使用了SILAC定量蛋白质组技术分析了这两个亚型病人的互作蛋白的差别，及对整个细胞磷酸化信号通路的影响。结果表明这两个亚型蛋白能够结合到不同的亚细胞结构，并激活不同的信号通路。该研究成果于近期发表在著名医学期刊Leukemia上。景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作。

关键词：磷酸化、蛋白质相互作用、白血病、外泌体、SILAC

研究思路和成果：

在白血病中，BCR-ABL是一个重要的癌基因，该癌基因可以由BCR基因和ABL基因通过相应区域的染色质移位所导致，而不同位置的融合将会导致不同的亚型，其中最常见的两个亚型依据其分子量分别被命名为p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL。尽管这两个亚型较为相似，但是其所导致的临床表型却差别巨大：p190^BCR-ABL通常导致急性淋巴白血病（ALL）而p210^BCR-ABL通常导致慢性粒细胞白血病（CML）。同时，这二者所导致的不同类型白血病对包括激酶抑制剂在内的化疗药物的临床敏感性也不同。而进一步解析这两种亚型白血病的差别和机制，无疑对于今后的治疗有着重要意义。而基于质谱的蛋白质组技术的发展无疑为该类型的研究提供了有力武器。

作者从这两个融合蛋白的互作蛋白及其对整个系统信号通路的影响两个方面入手，采用SILAC的定量蛋白质组学技术进行研究（图1）。在p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL的差异互作蛋白方面，作者使用了BioID的互作蛋白检测体系，该体系将BirA融合到蛋白前端，而融合有BirA的蛋白会导致与其相互结合（包括短暂相互作用）的蛋白被生物素化，而这些生物素化的蛋白可以通过链霉素亲和层系然后进行质谱检测（图1 a, b）。

图1 BCR-ABL互作蛋白组和磷酸化修饰组的检测方案

利用BioID方法，作者从了三次重复中共同鉴定到90个特异的BCR-ABL的互作蛋白，并使用WB的方法做了验证。作者的互作蛋白鉴定结果和以往的文献报道高度一致。通过设定1.8倍的变化阈值来筛选在p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL之间有显著差异的互作蛋白，作者发现很多细胞骨架重塑相关的蛋白都与p190^BCR-ABL结合更强，如WASP、Wipf1、Wasf2、Nck1、Sipa1等；而很多细胞膜相关的蛋白则与p210^BCR-ABL的结合更强，包括Ubash3b、Cbl、SHIP2等（图2）。

图2 利用BioID技术分析BCR-ABL互作蛋白组的差异

酪氨酸磷酸化修饰在细胞骨架蛋白和细胞膜相关蛋白的调控中发挥重要作用。为了进一步阐明p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL导致的细胞信号通路的变化，作者使用三标SILAC体系比较分析了过表达p190^BCR-ABL 或p210^BCR-ABL的细胞与对照组细胞酪氨酸磷酸化修饰组的差别（图1c）。从WB实验的结果可以看出过表达p190^BCR-ABL 或p210^BCR-ABL的细胞总体酪氨酸磷酸化水平显著高于无过表达的对照组细胞（图3a）。作者从三次技术重复的实验中共同定量到了746个酪氨酸磷酸化位点。作者选择2倍变化阈值来筛选在p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL之间有显著差异的酪氨酸磷酸化位点，并对其中的部分定量结果进行了WB的验证（图3b,c）。和互作蛋白组的数据相一致，很多细胞骨架蛋白的酪氨酸磷酸化水平也在p190^BCR-ABL组中升高，包括Wasl、Wipf1/2等。同时，作者也发现与p210^BCR-ABL结合加强的细胞膜相关蛋白等其酪氨酸磷酸化水平也有上升。这些结果表明很多细胞骨架或细胞膜相关的蛋白是从相互结合和酪氨酸磷酸化两个水平上受到了p190^BCR-ABL的影响。除了有相互作用的蛋白以外，p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL还能够间接影响很多其他蛋白的酪氨酸磷酸化水平，其中包括一些磷酸激酶如Lyn、Csk、Tec、Sky等（图3e）。

图3 p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL导致的酪氨酸磷酸化修饰组的差异

最终，作者将以上结果做了一个总结（图4）。p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL的大部分互作蛋白是一致的，而这部分蛋白其酪氨酸磷酸化水平都没有显著差别；相反，少部分差异的互作蛋白同样在酪氨酸磷酸化水平上也表现出差异，这表明相互作用和酪氨酸磷酸化水平之间有一致的关系。p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL分别通过细胞骨架相关信号通路和细胞膜相关信号通路最终影响了细胞的表型和不同类型癌症的发生。

图4 p190^BCR-ABL 和p210^BCR-ABL的作用机制总结图

参考文献：Cutler J A, Tahir R, Sreenivasamurthy S K, et al. Differential signaling through p190 and p210 BCR-ABL fusion proteins revealed by interactome and phosphoproteome analysis. Leukemia, 2017.

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