时空并行---- 利用定量蛋白质组学研究蛋白质互作网络的动态变化

景杰编者按：细胞的正常生理活动离不开蛋白质网络的高效、精确的时空调控，因此研究蛋白质互作网络的动态变化需要从以下三个方面来研究：蛋白质互作网络的成员鉴定、其在时间、空间上的变化。质谱结合亲和纯化（AP-MS）可以在时间维度上研究蛋白质相互作用， 也能结合亚细胞分级获得蛋白质网络在空间上分布的信息，但是该方法难以研究蛋白质组瞬时互作的变化。因此如何更加精确地研究蛋白质互作网络是一个亟待解决的问题。美国加利福尼亚大学的研究人员以工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）介导的瞬时标记方法为基础，结合定量蛋白质组学技术，有效地解决了同时捕捉蛋白质互作网络中时空两个维度信息的问题。研究人员通过研究G蛋白偶联受体（GPCRs）介导的蛋白质互作网络证明，该方法能够确定目标蛋白互作网络组成，进行亚细胞定位，捕捉与目标蛋白瞬时结合以及低亲和力partners的信息，成功鉴定了蛋白质互作网络中未能发现的players。上述成果发表在著名期刊Cell上。景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作。

关键词：APEX Proximity Labeling, Quantitative Proteomics, AP-MS, Protein Interaction Networks

研究思路和成果：

图 1 APEX捕捉蛋白的互作网络

首先研究人员将APEX2与B2AR和DOR受体融合，在HEK293细胞中稳定表达了B2AR-APEX2 和DOR-APEX2片段。激动剂刺激受体活化之后，β-视紫红质抑制蛋白（arrestin3）与受体短暂结合，定量蛋白质组学检测到arrestin3的丰度上升了6倍，证明APEX能够捕捉arrestin3和GPCRs在激动剂刺激下的短暂的互作信息。激动剂刺激之后，不同时间段检测B2AR-APEX标记水平，可以显示出不同时间段与受体结合的蛋白种类，该结果与western blot和SRM方法所验证的结果一致。APEX标记被证实能够捕捉亚基解离的信息，用于不同亚基的解离动力学研究。证明APEX和MS-based label-free定量技术相结合可以捕捉与GPCRs互作的低亲和性，短暂互作和间接互作的蛋白信息（图2）。

图 2 特定空间参照的选择检测出GPCR互作蛋白与普通区室蛋白的表达差异

受体附近存在一些区室特定的非互作蛋白，存在目的蛋白附近，不与其发生物理作用，也不参与其功能，也就是bystanders。研究发现GPCR-APEX融合策略也能标记bystanders蛋白，并且发现这些蛋白并不是没有意义的，它们可以提供有用的受体位置信息（图 2 A, B, C）。实验通过选取空间特异性的参照系统RM-APEX2证实B2AR互作网络中，bystanders蛋白OCLN和RDX的丰度并没有差异，但是受体激活之后发现arrestin3和AP2复合物的丰度显著高于参照系统PM-APEX2。这将有助于区分bystanders蛋白与代谢网络组分。（图2 D, E）结果表明特定的空间参照条件结合label-free MS-based的定量，使得APEX临近标记的网络组分和bystanders得以区分。

图 3 时间分辨的临近标记和空间特定的反褶积确定δ阿片受体的互作蛋白

接下来，研究人员利用选取空间参照的方法研究了未知的互作网络--- DOR互作蛋白网络，来探索该受体下调的分子和细胞基础。受体被激动剂激活之后，在不用时间段比较DOR-APEX标记与相对应参照强度的差异，鉴定出DOR-APEX标记信号比参照更强的蛋白。FDR为0.05，利用SAINT的方法，首次获得了48个特异性蛋白，为了更灵敏更准确地定量，利用定量蛋白质组学的方法重新评估，最后蛋白质组学分析确定了29个与受体和参照的丰度有显著的差异性（p<0.05）的蛋白，这些蛋白的分级聚类和定量结果发现受体被激活之后1-3 min，ARRB2和与网格蛋白介导的内吞功能相关的蛋白AGFG1, ITSN2, EPN2和PICALM丰富最大，中期和后期发现与受体的胞内分选相关的蛋白如中期的ZFYVE20, TGFBRAP1, SCAMP3 和后期的MYOF, WWP2（图 4）。

图 4  WWR2和TOM1是泛素网络的组分并且与DOR向溶酶体运输相关的鉴定

WWP2和TOM1的功能与泛素相关，为了验证其功能利用siRNAs的方法将其敲除，发现WWP2和TOM1的敲除都会抑制受体DOR的降解速率。同时验证了两个蛋白的敲除都不会引起DOR内化的变化，由此确定了两个与受体降解相关的蛋白组分WWP2和TOM1。

总结：本文通过APEX临近标记和定量蛋白质组学结合特定空间参照的方法，使得在时空两个维度上研究蛋白质网络中的“what”，“where”和“when”成为可能，为生物学在分子水平上的研究提供了基础。

参考文献：

Braden T. Lobingier, et al. (2017). An Approach to Spatiotemporally Resolve Protein Interaction Networks in Living Cells. Cell 169, 350-360.

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