蛋白质组学鉴定调控果蝇发育的O-GlcNAc修饰蛋白
景杰编者按：O-GlcNAc是核蛋白、细胞质蛋白上广泛存在的可逆糖基化修饰，该修饰主要发生在蛋白质丝氨酸、苏氨酸残基，主要由OGT(O-GlcNAc转移酶)以及OGA(O-GlcNAc水解酶)动态调控的蛋白质翻译后修饰。在模式生物中，蛋白质O-GlcNAc糖基化参与胚胎早期发育的调控。但是因为找不到好的富集手段，被修饰蛋白的鉴定工作进展缓慢。日前，来自英国的研究者将细菌OGA进行遗传改造，通过突变使其丧失水解功能，但是仍然保持其结合功能，实现O-GlcNAc糖基化蛋白的高效富集，鉴定到大量和果蝇胚胎发育时期O-GlcNAc糖基化蛋白质，该项工作发表于著名学术期刊Nature Chemical Biology。景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作。
关键词：O-GlcNAc、糖基化修饰、PTM、胚胎发育
研究思路和成果：
蛋白质O-GlcNAc糖基化是生物对营养条件、细胞刺激等条件的响应，参与基因表达、蛋白转运或降解、应激反应和细胞自吞噬等广泛的细胞生理生化过程。组织特异性蛋白O-GlcNAc糖基化改变已被报道与大量人类疾病有关，包括糖尿病、肿瘤、心血管疾病以及神经退行性疾病。前期的报道表明OGT催化的蛋白质O-GlcNAc糖基化在动物胚胎发育中具有重要作用，然而其发挥功能的分子机制尚且欠缺。对生物样本中O-GlcNAc蛋白组的质谱鉴定，由于目前采取的富集方式：BEMAD富集、麦胚凝集素（WGA）亲和色谱富集或O-GlcNAc抗体CTD110.6富集，上述方法存在富集效率低或特异性差等问题，造成O-GlcNAc糖基化修饰蛋白质谱鉴定效果不理想。因此研究者们一直在寻找更好富集策略。
本文研究者在产气荚膜杆菌（Clostridium perfringens）中发现一种真核生物OGA同源蛋白CpOGA，其具有和人类hOGA51%的序列相似性并且对人O-GlcNAc糖基化蛋白有显著的催化活性，研究者通过将CpOGA蛋白298位天冬氨酸突变为天冬酰胺（D298N），使突变CpOGA不具有O-GlcNAc催化活性但保持对O-GlcNAc糖基化蛋白结合能力。并且研究者进一步证明了其对O-GlcNAc糖基化蛋白的特异性结合，而不结合N-GlcNAc，证明了D298N突变的CpOGA可以用于亲和富集O-GlcNAc糖基化蛋白。
图1. 突变CpOGA蛋白结合O-GlcNAc糖基化蛋白示意图以及验证
随后，研究者比较了突变CpOGA以及目前使用的其他O-GlcNAc糖基化蛋白富集手段，通过pull down实验证实了突变CpOGA蛋白能够有效富集HeLa细胞裂解液中的O-GlcNAc糖基化蛋白，并且通过质谱鉴定到915种O-GlcNAc糖基化蛋白，其中包括已报道的糖基化蛋白如组蛋白H2A、H2B、H3、H4以及c-Rel、CREB、TAB1、OGT等。相较于前期另一项研究在HeLa细胞中鉴定到199种糖基化蛋白，利用突变CpOGA亲和富集能够提高富集效率以及特异性，也不需要特殊标记。
图2. 利用突变CpOGA对O-GlcNAc糖基化蛋白进行Pull down以及质谱鉴定
第三，研究者将突变CpOGA应用于对果蝇胚胎O-GlcNAc糖基化蛋白修饰组分析，质谱鉴定到了3558种蛋白，和对照相比 （利用CpOGA D298N D401A双突变，不具有结合O-GlcNAc蛋白能力），其中有2358种蛋白被显著富集，其中2044种蛋白通过PANTHER鉴定用于GO分析。结果有678种属于核质蛋白，84种膜蛋白（图2c）。对这些蛋白进行分类分析，约14%为核酸结合蛋白，大多数参与RNA运输与加工 （图 3）。并鉴定到Gug、mop等多种OGT糖基化底物蛋白，表明蛋白糖基化参与调控胚胎发育时期的重要过程。同时质谱也鉴定到参与泛素化蛋白酶体、DNA复制、细胞凋亡等途径的蛋白，有趣的是很多参与蛋白也和亨廷顿疾病以及帕金森综合症发病机理相关。而且后续的遗传实验表明，一些蛋白OGT糖基化和果蝇发育有关，修饰位点突变后会导致果蝇发育异常 （图 4）。
图3. 果蝇胚胎O-GlcNAc糖基化蛋白大多数参与RNA运输与加工
图4. 突变CpO 46 26180 46 12110 0 0 5167 0 0:00:05 0:00:02 0:00:03 5166GA亲和富集质谱鉴定蛋白分类以及OGT糖基化对部分蛋白（Gug、mop）功能的影响验证
总结：本文鉴定并且验证了D298N突变CpOGA作为一种O-GlcNAc糖基化蛋白结合蛋白，适用于更简单的O-GlcNAc糖基化亲和富集手段，应用于基于质谱的蛋白质糖基化修饰组研究，有助于帮助研究者发现蛋白O-GlcNAc糖基化在多种生命过程以及疾病发生中的作用机理。
参考文献：
Selvan, N. et al. A mutant O-GlcNAcase enriches Drosophila developmental regulators. Nat Chem Biol . 13, 882–887 (2017).
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