“如虎添翼”-细胞应激条件下，SIRT1的O糖基化修饰激活其去乙酰化酶活性

景杰编者按：SIRT1是哺乳动物sirtuins家族中，进化上最保守的去乙酰化酶，其在代谢调控，应激反应，基因组稳定性和衰老的调控中起重要作用。作为应激传感器，SIRT1的去乙酰化活性在应激时显著增加，于此同时，O-GlcNAc，一种蛋白质翻译后糖基化修饰，在细胞应激反应的应答中，其含量也是增加的。那么SIRT1的活性是否也受到O-GlcNAc修饰的调控？中国海洋大学于文功课题组证实了， SIRT1的O-GlcNAc修饰增强了其去乙酰化酶活性。在应激状态下，SIRT1的O-糖基化水平及去乙酰化活性显著升高，通过使p53和FOXO3等关键蛋白去乙酰化调控细胞存活和凋亡的平衡。上述结果发表在著名的学术期刊NATURE COMMUNICATIONS。景杰生物作为全球蛋白质组学翻译后修饰组学的领跑者，可以为您提供一整套O糖基化修饰组学研究的解决方案，助力您的研究工作。

关键词：SIRT1、O糖基化修饰、应激反应、去乙酰化酶、p53

研究思路与结果

SIRT1是NAD⁺依赖的去乙酰化酶，其去乙酰化作用既调控着组蛋白也调控着非组蛋白，如p53，FOXO3，Ku70，PPAR γ，NF-kB。尽管目前发现SIRT1的活性受到NAD⁺/NADH⁺比例，蛋白相互作用，蛋白翻译后修饰的调控，但在生理和应激条件下其酶活的调控机制仍未可知。O糖基化通常发生在细胞核和细胞质蛋白的丝氨酸或苏氨酸羟基上。与SIRT1相似的是O糖基化也是应激传感器。在对不同细胞应激反应的应答中，O糖基化水平增加，随之通过参与一系列生物过程如PI3K/Akt途径，热休克蛋白表达，钙稳态，活性氧的水平，内质网应激提高细胞生存率。本文中作者从SIRT1是否发生O糖基化修饰？O糖基化发生在SIRT1的哪个位点？这个位点的O糖基化修饰是否影响SIRT1的去乙酰化酶活性？在应激反应中O糖基化对SIRT1去乙酰化酶活性是否有影响？应激反应中O糖基化的SIRT1发挥保护作用的机制是什么？

• 1. 作者通过交互的Immuno-blotting证明O糖基化催化酶（OGT）与SIRT1互作，免疫荧光实验发现SIRT1和OGT定位在细胞核中，并发现OGT结合在SIRT1点C端结构域而不是N端或中心结构域。通过代谢标记和化学标记的方法发现过表达OGT或加入OGA特异抑制剂（TMG）都增加了SIRT1的O糖基化修饰水平。从而表明SIRT1是OGT的底物并被O糖基化修饰（图 1）。

图1. 左图，糖基转移酶OGT和SIRT1相互作用。右图，SIRT1在体内发生O糖基化修饰。

• 2. 纯化出O糖基化的SIRT1，用ETD-MS分析发现O糖基化发生在SIRT1 549位的丝氨酸上，而S549位于SIRT1的C端结构域，同时也是OGT结合的区域。并且SIRT1的S549位点O糖基化在人和其他哺乳动物中高度保守。为了确定S549是SIRT1O糖基化的主要位点，将549位点的丝氨酸突变成丙氨酸(SIRT1^S549A)，SIRT1O糖基化水平显著降低（图 2）。

图2. SIRT1的O糖基化主要发生位点549位点的丝氨酸上

• 3.  为了探索O糖基化在SIRT1去乙酰化酶活性中的作用，检测SIRT1的靶点：H3组蛋白和p53的乙酰化水平判断SIRT1的活性。结果显示wild typeSIRT1和SIRT1^S549A在生理状态下去乙酰化活性无显著差异，而当TMG处理后SIRT1的活性增强而SIRT1^S549A无变化。同样，当与OGT共表达时， SIRT1^S549A的去乙酰化酶活性与SIRT1相比显著降低。这些结果揭示SIRT1的O糖基化对于调控SIRT1的催化活性非常重要（图 3）。

图3. SIRT1的S549位O糖基化增强其去乙酰化酶活性

• 4. 在细胞模型和小鼠模型中测试应激刺激下SIRT1的O糖基化水平。结果显示，应激导致SIRT1的O糖基化以一种时间依赖的方式高度动态变化。同时，应激刺激下wtSIRT1的O糖基化水平升高的程度高于SIRT1^S549A（图4）。

图4. 应激刺激SIRT1O糖基化水平升高

• 5. SIRT1被认为在应激状态下保护细胞，其中一个主要的机制就是使p53的去乙酰化。研究结果显示，在生理状态下wtSIRT1和SIRT1^S549A能够抑制p53介导的转录活化。然而，在应激状态下，wtSIRT1的抑制能力明显强于SIRT1^S549A。RT-PCR检测内源性p53靶基因Cdkn1a的转录，结果显示在生理和凋亡剂处理的条件下wtSIRT1降低Cdkn1a的转录，但SIRT1^S549A的作用不明显（图5）。

图5.应激状态下S549O糖基化的SIRT1调控p53转录

综上所述，文章揭示了O糖基化修饰发生在SIRT1S549位点，并且修饰增强了SIRT1的去乙酰化酶活性。在应激状态下，SIRT1的O-糖基化水平和其去乙酰化活性均显著升高。O糖基化的SIRT1通过增强p53等一些列关键蛋白去乙酰化作用，增加了细胞存活率，但当O-糖基化位点突变后，SIRT1催化活性降低，提示SIRT1S549可能是调控细胞存活和凋亡平衡的分子开关（图6）。

图6. SIRT1的O糖基化修饰在细胞应激反应中调控的模式图

参考文献

Cuifang Han, et al. (2017) O-GlcNAcylation of SIRT1 enhances its deacetylase activity and promotes cytoprotection under stress . NATURE COMMUNICATIONS 8, 1491

景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。

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