蛋白质组学揭示神经元分化过程中的蛋白动态变化

景杰编者按：神经分化是一个多步骤的过程，通常包括几个典型的阶段：突生长、树突和突触的形成，这其中的每个阶段涉及大量的生物学过程，系统生物学为我们从全局上了解上述过程提供了极好的手段。但是，之前的研究大多集中在转录组的动态变化，但是基因在转录水平的变化不一定能代表最终功能执行者蛋白质的变化。为了系统地在神经分化过程中蛋白质的动态变化，来自荷兰乌特勒支大学研究人员对不同发育阶段培养的大鼠海马神经元进行了研究，结合稳定同位素标记和高分辨率蛋白质谱来监测蛋白质丰度的变化。结果表明，在可定量的4500种蛋白中，近1/3的蛋白在神经元分化过程中发生了2倍以上的表达变化，这表明神经元蛋白质组有广泛的重构。研究人员也发现神经-细胞粘附分子1(NCAM1)可通过促进树突生长锥的肌动蛋白纤维生长从而刺激树突的生长。上述研究发表在著名的学术期刊Cell Reports上。景杰生物作为全球蛋白质修饰抗体和高分辨率蛋白质组学技术的开拓者与领跑者, 通过和全球科研人员的深度合作，在蛋白质组学和蛋白质修饰组学研究领域不断推陈出现，极大地推动了相关研究的进展。景杰生物可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，助力您的研究工作。

关键词：

动态定量图谱、神经元分化、大鼠海马组织、神经-细胞粘附分子1(NCAM1)

研究思路与结果

为了研究神经元分化过程中的蛋白质表达的动态谱图，研究人员高通量蛋白组学方法对体外培养的大鼠海马神经元不同时期（轴突形成期DIV1, 树突生长期DIV5和突触发生和成熟期DIV14）的蛋白质变化进行了定量分析（图1A）。结果总共鉴定到了6753个蛋白，其中4354个蛋白有定量信息，有1793个蛋白质显示超过2倍的表达变化，表明在分化过程中至少有1/3的神经元蛋白发生重构。富集分析揭示了该数据集覆盖了海马神经元特异性相关的大部分蛋白(图1 B)，平均相对蛋白丰度跨越5个数量级(图1C)。在25%的高丰度蛋白质中，存在许多神经特异性蛋白，并且GO富集分析发现这些蛋白显著定位于轴突和神经末梢(图1C)。

图1. 利用质谱分析不同分化阶段神经元细胞的蛋白质组动态变化

研究人员对所有显著变化的蛋白质进行表达模式聚类分析发现有6种表达模式。这6种表达聚类模式中蛋白在细胞成分、分子功能以及生物过程方面具有共同的特性(图2)。聚类1从DIV5到DIV14显著增加，其中包含了参与多糖、氨基酸和脂类代谢在内的多种代谢过程的蛋白质(图2B)。进一步分析发现，它们中的大多数在溶酶体中起催化酶作用(例如，导管蛋白酶L1,arylsulfatase B，和dipeptidyl肽酶2，图2 C)。聚类2从DIV1到DIV14一直在显著增加，主要是与阳离子传输和神经递质分泌有关的蛋白质，如多个ATP酶的高连接子单元(图2C)。此外，大部分受调控的突触蛋白也在聚类2中。聚类3从DIV1到DIV5显著增加，其中许多蛋白质与细胞粘附和细胞信号相关 (图2B)。聚类4从DIV5到DIV14显著减少，主要是与RNA代谢有关(图2B)。聚类5，表示相对蛋白水平随时间的持续下降(图2A)，富含与染色质相关的蛋白质(图2B)。其中组蛋白甲基转移酶(Ehmt1和Wdr5)、乙酰转移酶(Kat8和Hat1)、组蛋白(Hist1h1b、Hist1h1a、H2afy2)的稳定下调表明，在神经元分化过程中，染色质结构正在进行重构(图2C)。聚类6从DIV1到DIV5显著下调，主要参与分裂后神经元的早期分化过程，以细胞周期调控和DNA复制等多种蛋白为主，如DNA螺旋酶。

图2. 差异表达的蛋白可以分为 6种动态表达模式

细胞黏附分子在神经元发育过程中起着关键作用，它们介导轴突和轴突的接触形成，并进一步调节树突棘的形态和突触可塑性。有趣的是，在可定量的82个细胞粘附蛋白中，有 24个蛋白存在于聚类3 (图2A)。NCAM1属于免疫球蛋白样的细胞粘附分子，是最丰富的神经粘附蛋白。研究人员通过免疫荧光实验研究它在不同培养阶段的神经元中的分布，结果表明在DIV1-5，NCAM1主要存在于轴突生长锥和树突状生长锥中，在后期又逐渐消失（图3）。为了研究NCAM1在树突发育过程中的作用， 研究人通过基因敲除发现NCAM1的缺失降低主树突、总树突和树突分支的长度。

图3. NCAM1在神经元发育过程中的表达情况

通过亲合层析-质谱（AP-MS）分析，结果发现NCAM1互作的为多为肌动蛋白-细胞骨架相关蛋白。为了检测NCAM1与肌动蛋白-细胞骨架蛋白的相互作用在神经元发育发育中的作用。研究人员利用稳定肌动蛋白纤维以促进肌动蛋白聚合的药物Jasplakinolide处理NCAM1敲除细胞株， 结果显示细胞培养基中加入低剂量的jasplakinolide (10nM)，可在一定程度上挽救了NCAM1耗竭引起的神经元发育缺陷 (图4)。这表明，NCAM1可通过稳定肌动蛋白的聚合从而促进树突的生长。

图4. NCAM1在肌动蛋白-细胞骨架稳定中的作用

综上所述，研究人员通过对海马神经元发育的特定阶段进行蛋白质表达谱分析，有助于我们更好地理解神经发育的分子机制。此外基于质谱的定量蛋白质组学技术，比如多通量标记技术如TMT标记技术的改进，可使得我们对神经元发育过程中十个不同的阶段进行更加详细的分析，这必将进一步补充我们对神经元蛋白质动力学的理解。

参考文献

1. Christian K. Frese, et al. (2017) Quantitative Map of Proteome Dynamics during Neuronal Differentiation. Cell Reports 18, 1527–1542.

景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。