SIRT5调节SHMT2的去琥珀酰化水平而促进肿瘤增殖
景杰编者按：
线粒体丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT2）是一个磷酸吡哆醛（PLP）结合蛋白，能催化丝氨酸裂解成甘氨酸同时伴随着5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-CH2-THF）的产生，5,10-CH2-THF是嘌呤代谢关键的中间产物。SHMT2扮演着丝氨酸分解代谢和一碳代谢调节因子的作用，丝氨酸分解代谢和一碳代谢调节过程的一些小分子化合物控制着细胞增殖及细胞内的氧化还原代谢平衡。但是，SHMT2的翻译后调控机制还不清楚。
蛋白质赖氨酸侧链的琥珀酰化修饰最早由芝加哥大学赵英明教授实验室发现【1】，后续研究表明蛋白琥珀酰化修饰参与体内代谢途径的调控【2】。SIRT5是一个NAD+依赖型赖氨酸去乙酰化酶、去丙二酰化酶、去琥珀酰化酶、去戊二酰化酶，调控很多细胞内代谢过程。SIRT5也可以通过对琥珀酸脱氢酶复合体（GDH）、丙酮酸脱氢酶复合体（PDH）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）翻译后修饰调控糖酵解和TCA循环。
景杰生物和众多研究机构合作，推动蛋白质琥珀酰化修饰领域的研究进展。
比如和尚永丰院士、北京大学俞文华教授合作，发现Sirt7具有去组蛋白琥珀酰化酶活性，最终调控基因组的稳定性【3】。
SIRT5也可能参与到肿瘤的发生过程中。复旦大学赵世明、徐薇教授等人发现在IDH突变的glioma肿瘤中，R-2HG的导致琥珀酰辅酶A的积累，导致线粒体蛋白的过度乙酰化修饰，促进癌细胞代谢。【4】。
前不久，由北京大学罗建沅课题组在学术期刊Cancer Research发表文章，研究中发现SIRT5和SHMT2有直接的互作关系，在代谢应激反应中，SIRT5可以对SHMT2的K280进行去琥珀酰化修饰，从而增加SHMT2的活性，从而增强肿瘤细胞的丝氨酸代谢能力，最终促进肿瘤细胞的快速增殖【5】。这项研究为我们提供一条把SIRT5作为靶点，通过抑制serine代谢进而抑制肿瘤细胞增殖的可能治疗策略。
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关键词：
SIRT5、SHMT2、 琥珀酰化修饰、去琥珀酰化、丝氨酸代谢、肿瘤细胞增殖
研究思路和成果：
首先，研究者通过Co-IP结合MS鉴定实验筛选到和SIRT5强互作的蛋白SHMT2，并通过GST-pulldown进行验证。作者又用不同蛋白质修饰抗体进行筛选修饰水平的变化情况，结果发现NAM处理及SIRT5都能够显著的改变SHMT2的琥珀酰化修饰水平，初步证明SIRT5对SHMT2的琥珀酰化修饰发挥作用的，如图1H所示。
Figure 1. SHMT2 iden0tified from SIRT5 interaction network
接下来，为了验证SIRT5体内的功能，作者运用CRISPR/Cas9技术在U2OS细胞系中做了SIRT5的knoct out (KO)敲除。Serine/glycine饥饿处理结果显示，和WT 相比SIRT5 KO cells中氧化状态提升(NADPH/NADP+比例 、GSH/GSSH比例增加, ROS增加),细胞生长速率下降，如图2。互补实验证明，补充WT形式的SIRT5蛋白可以互补SIRT5 KO 细胞生长慢的表型，如图2G。说明，SIRT5对肿瘤细胞响应serine/glycine饥饿是非常必要的。
Figure 2. SIRT5 is irreplaceable for cancer cell in response to serine/glycine deprivation
为了进一步确定SIRT5对SHMT2的去琥珀酰化修饰作用，作者进行体外生化实验,结果发现随着SIRT5蛋白剂量的增加，去琥珀酰化修饰的SHMT2比例增加。用线粒体内三种不同的SIRT蛋白检测对SHMT2的去琥珀酰化作用，证明只有SIRT5表现出对SHMT2的强去琥珀酰化修饰作用。而SIRT5酶活缺陷型突变体SIRT5-H158Y和N端缺失突变体SIRT5Δ50均失去对SHMT2的去琥珀酰化修饰功能，如图3E、3F。体外实验也证明，只有野生型SIRT5表现出对SHMT2的去琥珀酰化修饰作用，综上所述，证明SIRT5的确具有对SHMT2的去琥珀酰化修饰功能。
Figure 3. SIRT5 desuccinylates SHMT2 in vivo and in vitro
那么，SIRT5对SHMT2的去琥珀酰化修饰到底具有怎样的生理功能呢？在细胞中过表达SIRT5可以增加SHMT2的活性，而在SIRT5 KO 细胞中，SHMT2琥珀酰化水平升高而活性下降(图4B、C)；并且，体外实验也证明，琥珀酰化形式的SHMT2表现出低酶活特点，(图 4D)以上结果表明，SHMT2的琥珀酰化水平和其酶催化活性紧密相关并且受SIRT5调控。为了验证SIRT5对SHMT2的调控在应对代谢胁迫时的作用，作者检测了serine/glycine饥饿处理下SHMT2的琥珀酰化水平。Serine/glycine饥饿处理时，过表达SHMT2或者提供内源SHMT2都会降低SHMT2的琥珀酰化水平。SHMT2的酶催化活性在低SHMT2的琥珀酰化水平更强。说明，SIRT5对SHMT2的去琥珀酰化修饰发生在细胞应对代谢胁迫时。
Figure 4. SIRT5 upregulates SHMT2 enzymatic activity under metabolic stress
接下来，作者用质谱鉴定到SHMT2的琥珀酰化修饰位点，并从中选取7个赖氨酸修饰位点进行验证，最后确定到K280是影响SHMT2的蛋白活性和功能的关键琥珀酰化修饰位点，SHMT2的蛋白晶体结构分析显示K280被琥珀酰化修饰后会抑制PLP的结合，如图5。
Figure 5. K280 is the major succinylation site of SHMT2
最后，作者又分别在两种细胞系U2OS和HCT116中证明SHMT2 K280E 细胞的细胞增殖速率显著下降，且在K280E突变型细胞中转入正常的SHMT2可以提高细胞增殖速率。并且作者用异种移植实验分别在小鼠皮下组织注射SHMT2 WT 细胞和SHMT2 K280E 细胞，结果发现，SHMT2 K280E 细胞小鼠的肿瘤体积和重量分别为注射SHMT2 WT 细胞小鼠的62.6%和56.1%，如图6B、6C。说明，SHMT2 K280E突变的确可以减少肿瘤细胞增殖速率。
Figure 6. Succinylation of SHMT2 at K280 impairs tumor cell growth
作者给出了一个SIRT5通过对SHMT2的去琥珀酰化修饰促进肿瘤细胞增殖的model对全文做了一个总结：Serine饥饿处理状态下，SIRT5可以对SHMT2进行去琥珀酰化修饰，促进SHMT2催化丝氨酸裂解成甘氨酸同时产生5,10-CH2-THF的过程，进而促进达到促进肿瘤细胞增殖的效果。
参考文献：
1. Zhihong Zhang, et al. (2011). Identification of lysine succinylation as a new post-translational modification. Nature Chemical Biology 7, 58-63.
2. Jeongsoon Park, et al. (2013). SIRT5-mediated lysine desuccinylation impacts diverse metabolic pathways. Molecular Cell 50, 919-930.
3. Lei Li, et al. (2017). SIRT7 is a histone desuccinylase that functionally links to chromatin compaction and genome stability. Nature Communications.
4. Feng Li, et al. (2015) NADP(+)-IDH mutations promote hypersuccinylation that impairs mitochondria respiration and induces apoptosis resistance. Molecular cell 60, 1-15.
5. Xin Yang, et al. (2017) SHMT2 desuccinylation by SIRT5 drives cancer cell proliferation. Cancer Research.
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