蛋白质组学揭示磷酸化修饰在神经细胞自噬过程中的重要作用

景杰编者按：2016年度诺贝尔生理学与医学奖颁给了日本科学家大隅良典(Yoshinori Ohsumi)，以奖励他在“细胞自噬机制方面的发现”。

大隅良典(Yoshinori Ohsumi)近照

自噬”(autophagy)一词源于希腊语“auto/自我” 和“phagein/吞食”的组合而成。因此， autophagy顾名思义就是“自我吞噬”。这一概念最早由诺贝尔奖获得者Christian de Duve于上世纪1960年代提出。Duve也因发现溶酶体获得1974年获得诺贝尔奖，他在细胞内发现了一种新型囊泡，此种囊泡可将细胞组分转运至溶酶体处以降解，因此创造autophagy一词来描述该过程。但自噬现象背后的分子机制还是由大隅良典使用芽殖酵母成功地解析，为理解自噬的重要生理功能重要作用铺平了道路，比如对饥饿的适应性以及对感染的应答。自噬基因的突变可以导致疾病，比如癌症和神经系统疾病。困扰人们的大多数神经退行性疾病，如阿尔兹海默症和帕金森综合症，这些疾病都和神经细胞胞浆内聚集蛋白的沉积及线粒体功能障碍有关。自噬过程可以强有力地清除这类聚集蛋白并且维持线粒体稳态。近些年研究表明，自噬作用的增强可以有效防止神经元退变，而巨自噬/自噬紊乱在一定程度上促使神经退行性疾病的发生。因此，自噬有望成为神经退行性疾病的潜在治疗靶标【1】。最近华中科技大学薛宇教授、香港浸会大学Min Li、青岛大学陈蕾蕾博士和杭州景杰合作，在著名学术期刊Autophagy上发表了磷酸化修饰在神经细胞自噬过程中作用的文章。该研究采用磷酸化蛋白质组定量及生信分析的方法，构建了由两个天然神经保护自噬增强药物corynoxine （Cory）和corynoxine B（Cory B）调控的磷酸化信号网络的文章。

corynoxine和corynoxine B的结构式

利用自己开发的软件iKAP，本研究预测了参与调控药物处理前后，参与调控磷酸化变化的激酶，随后的实验证实了其预测的可靠性。研究发现Cory可以下调一些已知的autophagy激酶如RPS6KB1，上调MAP2K2和PLK1。同时Cory还能通过autophagy促进Alzheimer相关的APP蛋白以及Parkinson相关的SNCA蛋白的清除。该研究不仅提供了如何用磷酸化蛋白组数据来鉴定蛋白磷酸化的调控因子，而且还发现MAP2K2和PLK1 在神经细胞自噬中的重要作用。景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作。

关键词：自噬、corynoxine、生物碱、柯诺辛、激酶活性、磷酸化、蛋白激酶

研究思路与结果：

蛋白质磷酸化是活细胞中最重要的翻译后修饰之一，参与大量生物学过程，如细胞周期、信号转导、分化、增殖、代谢以及自噬。蛋白质技术LC/MS-MS的快速发展为详细研究蛋白磷酸化修饰提供机会。在本文中，研究人员首先采用SILAC标记技术，分别在N2a细胞的Cory、Cory B处理组和对照组中标记上不同的同位素（图1）。通过质谱共鉴定到5328个特异性磷酸化肽段，定量到2233个磷酸化蛋白和5413个特异性磷酸化位点，其中p-Ser、p-Thr、p-Tyr的位点比例分别约为87.7%（4749）、11.9%（643）、0.4%（21）。

图1. 神经细胞的磷酸化组学定量鉴定

以2倍为阈值发现Cory处理组有126个磷酸化位点上调和103个磷酸化位点下调，在Cory B处理组中91个磷酸化位点上调和98个磷酸化位点下调。研究人员将196个Cory处理组中的蛋白和168个Cory B处理组中的蛋白与THANATOS数据库（包含与自噬、细胞坏死和细胞凋亡相关蛋白的综合数据库）中763个与自噬相关的小鼠蛋白进行匹配，结果显示有19个在数据库中已被注释为自噬调节子的磷酸化蛋白（图2G）。基于对磷酸化蛋白的GO注释进行富集分析，结果表明Cory和Cory B这两种化合物对神经细胞自噬具有潜在的调控机制（图H）。

图2. 磷酸化蛋白分析。

G，Cory和Cory B两个处理组中磷酸化蛋白与THANATOS数据库蛋白匹配。

H，基于GO注释富集分析由Cory和Cory B不同调控的生物学过程。

为探究在两个处理组中是否存在起直接作用的蛋白激酶，研究人员采用iKAP算法从磷酸化组学数据中预测激酶活性改变（图3）。研究人员把磷酸化肽段上修饰变化的定量比值作为重量信息，在磷酸化网络中明确地反应出蛋白激酶对底物的差异调控。为研究由药物处理引起的激酶活性变化，首先从磷酸化网络中提取360个单一激酶网络，然后分为上调网络（磷酸化位点ratio>1）和下调网络（磷酸化位点ratio<1）（图3C）。经统计学检验得到，在Cory处理组中显著上调和下调的蛋白激酶分别有38和43（个），在Cory B处理组中显著上调和下调的蛋白激酶分别有22和35（个）。

图3. iKAP算法分析激酶活性变化。

A，预测特异性位点激酶与底物关系及激酶与底物间PPI。

B，激酶位点磷酸化建模。

C，所有单一激酶网络按ratio>1和ratio<1分为上调网络和下调网络。

为进一步研究哪些蛋白激酶参与了由Cory或Cory B引起的自噬，研究人员将所有的激酶与THANATOS数据库中118个注释为自噬调节子的小鼠蛋白激酶进行匹配，从结果中可以看出CDK1的激酶活性在Cory和Cory B两个处理组中都显著上调，这表明细胞周期在神经保护自噬过程中普遍被调控，而有一部分激酶只受Cory或Cory B处理影响，如RPS6KB1的磷酸化水平和激酶活性在Cory处理后显著下调（图4C）。

图4. 基于磷酸化蛋白组学鉴定潜在参与神经细胞自噬的蛋白激酶

iKAP预测结果显示MAP2K2和PLK1在Cory诱导的自噬中表现为上调（图4C）。MAP2K2与肿瘤的发生相关并参与RAS-RAF-MAP2K/MEK-MAPK/ERK级联反应通路；PLK1通常在人肿瘤中过表达，作用于细胞周期的M期，抑制PLK1激酶活性会导致癌症病人体内正常细胞凋亡、坏死，自噬作用减弱。研究人员在总蛋白和磷酸化水平上分别进行WB检测MAP2K2 S222位点和PLK1 T210位点 ，结果证实了Cory上调MAP2K2和PLK1两个位点的磷酸化水平。

图5. WB检测总蛋白水平和磷酸化水平上三个激酶的磷酸化修饰变化

为验证MAP2K2和PLK1是否参与神经细胞自噬，研究人员采用siRNA敲低了Map2k2或plk1的表达，结果表明MAP2K2主要参与Cory引起的神经细胞自噬（图6），而PLK1在神经细胞自噬中受两种化合物的调控。接着，通过分别使用激酶抑制剂U0126和BI2356进一步验证MAP2K2和PLK1在Cory引起的神经元保护作用中的重要性。研究表明可以，cory通过autophagy促进Alzheimer相关的APP蛋白以及Parkinson相关的SNCA蛋白的清除（图6）。

图6. 左图，MAP2K2参与调控化合物诱导的神经细胞自噬。

右图，抑制MAP2K2和PLK1会减弱Cory诱导的对过表达 SNCA蛋白的清除。

总结：研究人员利用自己开发的iKAP算法，从磷酸化修饰组学数据中预测具有差异调控的蛋白激酶，并用实验证实了这种方法的准确性及有效性。Cory在神经细胞自噬中显著上调MAP2K2的激酶活性和PLK1的磷酸化水平，其中MAP2K2主要参与Cory引起的自噬，PLK1参与Cory和Cory B两种化合物引起的自噬，这表明MAP2K2和PLK1在神经退行性疾病的自噬中起重要作用，将有助于神经退行性疾病方面的实验及临床研究。

参考文献：

1. Fiona M. Menzies, et al. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience 2015; 16(6): 345-357.

2. Lei-Lei Chen, et al. Phosphoproteome-based kinase activity profiling reveals the critical role of MAP2K2 and PLK1 in neuronal autophagy. Autophagy 2017; 1969-1980.

景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。