蛋白质磷酸化组学揭示胰腺癌对Kras抑制的可逆性抵抗机制

景杰编者按：肿瘤对靶向药物的耐药性是临床实践的一大难题，深入了解癌细胞的耐药机理是癌症研究的热点之一。目前研究表明，癌细胞的耐药性和其蛋白质磷酸化信号通路的变化有关。德国慕尼黑理工大学的研究者在Cancer Research发表论文，综合分析了拉帕替尼敏感和耐药细胞系中的蛋白质组和磷酸化组，发现AKT信号通路和糖酵解过程在耐药细胞系中发生显著改变，提示这些信号途径和代谢通路可以作为针对性的治疗靶标[1]。

细胞粘附相关蛋白的磷酸化在肿瘤发生发展中也发挥着中要作用。芝加哥大学Xiaoyang Wu教授和赵英明教授，中科院上海药物所谭敏佳研究员等人合作， 在国际著名期刊EMBO Journal上发表研究成果。他们对表皮祖细胞分化前后的磷酸化修饰水平进行了定量比较[2]。结果发现修饰水平变化最显著的是与细胞黏着相关的桥粒蛋白（desmosome proteins），其中桥粒蛋白PKP1的磷酸化水平又受激酶RIPK4的调控，且在细胞分化后显著上调。

今天和大家分享的这篇论文是研究磷酸化和癌症相关性的研究。Kras的激活突变是胰腺导管癌（PDAC）遗传学改变的标志，也是肿瘤发生发展中的决定性驱动因素。研究人员很长一段时间基于PDAC依赖激活的Kras这一理论基础，致力于开发Kras抑制剂，但是这一理论基础目前备受争议。Tyler Jacks教授最近在Cancer Research上发表文章，发现胰腺癌细胞在Kras被抑制的条件下发生的适应性和可逆性抵抗，通过磷酸化蛋白质组学阐述了细胞依赖粘着斑相关蛋白的磷酸化水平的上调而存活的原理。

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研究思路和成果：

首先作者采用doxycycline(DOX)构建了诱导敲降（knock down）体系，在小鼠PDAC细胞中有控制的对Kras高效率的稳定敲降，蛋白水平的敲降效率在70%以上（图1C）。随后在体外实验中，虽然短期诱导（ST DOX）和长期诱导（LT DOX）敲降Kras的细胞生长能力均减退，但作者同时指出PDAC细胞可以耐受稳定敲降Kras，肿瘤细胞仍然是可增殖的（图1D-F）。同时体内实验也证明了这一点。

Figure 1. Murine PDAC cells tolerate stable Kras knockdown invitr

and in vivo.

目前普遍认为，抑制促癌基因的手段之所以后期产生耐受性，是因为淘汰了抑制剂敏感细胞，而使得天然耐受群体得以存活和发展（类似于青霉素的对细菌耐药性的筛选过程）。但作者发现敲降Kras并不会产生大多数克隆的消亡，而只是变小（图2B），并且一旦停用DOX（WD DOX），细胞恢复生长活力（图2E）。所以作者认为PDAC细胞适应了敲降Kras的环境，激活了其他的“补偿通路”而非选择过程，并且细胞受Kras的影响是可逆的。

Figure 2. The Kras-inhibited state is adaptive and reversible.

既然对Kras的抑制影响PDAC的克隆形成，那么在3D培养下Kras是否影响肿瘤发生呢？作者发现抑制Kras可以在体外抑制细胞的成球能力（图3B），在体内抑制肿瘤起始细胞（tumor-initiating cells）（图3E）。这些都预示着Kras是一个有价值的治疗靶点。

Figure 3. Characterization of tumor-initiating properties of Kras-inhibited PDAC cells.

为了探求Kras抑制状态下的分子和生化改变，作者通过RNA-sequencing检测了Kras敲降后的基因表达差异，但并没有发现显著的基因表达差异（图4D），提示Kras的抑制效应并不依赖转录水平的改变。通过基因集富集分析（GSEA），作者发现在Kras被抑制的细胞中富集的基因主要与受体酪氨酸激酶（RTK），PI3K/AKT通路等有关（图4E）。

Figure 4. Gene expression analysis of Kras-inhibited cells shows minimal transcriptional changes.

而这两个方面都与蛋白质的磷酸化有关，因此，作者考虑检测总的蛋白质磷酸化的水平。但鉴于RTK磷酸化芯片（phospho-RTK array）通量较低，不能无偏向性的发现RTK磷酸化的差异靶点。因此作者采用SILAC和iTRAQ两种蛋白质组学的研究方法进行总的蛋白质磷酸化组学分析（技术路线如下图A,B），并且同时进行蛋白质组学分析，从而对磷酸化的蛋白进行归一化处理。

作者随后对SILAC和iTRAQ磷酸化的数据进行联合分析。iTRAQ实验中发现有很多粘着斑相关蛋白的（focal adhesion-associated proteins）磷酸化位点上调（图5C），同样的结果也在SILAC实验中出现（图5D）。

Figure 5. Unbiased phosphoproteomic analysis of signaling alterations in Kras-inhibited cells.

因此作者猜想Kras抑制的细胞可能更依赖细胞粘附而存活，实验结果也证实了其猜想，在Kras被抑制的细胞中，粘着斑结构显著增强（图6A），并且贴壁能力更快（图6D），总的来说，Kras被抑制的细胞粘附能力更强，更依赖细胞粘附存活。

Figure 6. Kras-inhibited cells exhibit enhanced adherence propertiesand dependence.

总结：

本文在前面工作基础上，通过磷酸化蛋白质组学，寻找到细胞在Kras被抑制后的细胞存活机制，为今后新的Kras抑制剂的开发和胰腺癌的治疗有着重要的临床意义。

当然这篇文章还有很多后续问题亟待解答，粘附蛋白的磷酸化位点的不同是否影响细胞的存活能力？调控这些粘附蛋白的酶有哪些？是否与其他修饰有cross talk？文章通过基因集富集分析（GSEA）发现，除了RTK和PI3K/AKT，还与氧化还原修饰代谢有关（图4E），那么能否从氧化还原修饰的角度解答细胞的耐药机制？这些地方依然有待于我们深入挖掘和揭示，因此研究蛋白翻译后修饰的分子机制具有很大的研究和应用价值。

参考文献：

1.  Benjamin Ruprecht, et al. (2017) Lapatinib resistance in breast cancer cells is accompanied by phosphorylation-mediated reprogramming of glycolysis, Cancer research 77, 1842-1853.

2.  Philbert Lee, et al. (2017) Phosphorylation of Pkp1 by RIPK4 regulates epidermal differentiation and skin tumorigenesis, The EMBO journal 36, 1963-1980.

3. Pan-Yu Chen, et al. (2017) Adaptive and reversible resistance to Kras inhibition in pancreatic cancer cells. Cancer research. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-2129

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