“分饰两角” -------CPT1A(肉碱棕榈酰转移酶1A)具有琥珀酰转移酶活性
景杰编者按：
最近，景杰生物和美国Mayo Clinic的 Taro Hitosugi教授合作，在著名的学术期刊Cell Reports上报道一种新的琥珀酰化转移酶CPT1A 【1】。依靠景杰生物的琥珀酰化修饰定量蛋白质组学平台，研究人员利用SILAC定量质谱，鉴定了101个潜在的受CPT1A调控琥珀酰化修饰的底物蛋白。和之前SIRT5的靶蛋白主要定位线粒体不同，本研究发现受CPT1A调控的很多蛋白定位于细胞质中，暗示其参与了非线粒体相关的生物过程。
蛋白质赖氨酸侧链的琥珀酰化修饰最早由芝加哥大学赵英明教授实验室发现【2】，后续研究表明该修饰广泛参与体内代谢途径的调控，具有非常重要的生物学意义【3】。
关于琥珀酰化修饰的调控，目前已经鉴定琥珀酰转移酶有p300，加上不久前美国安德森癌症中心吕志民、Rice大学陶怡芝和清华大学邢东明教授等在Nature报道的GNAT家族成员KAT2A【4】。KAT2A和酮戊二酸脱氢酶复合体α-KGDH结合，在细胞核内形成复合体，行使其高特异性的琥珀酰转移酶的活性，提高组蛋白H3K79的琥珀酰化水平，影响基因的表达调控，最终促进肿瘤的生长。
已报道的去琥珀酰化酶的研究有SIRT5：分别由芝加哥大学赵英明教授课题组【5】、康奈尔大学林和宁教授、香港大学郝权教授报道【6】。该酶同时具有去琥珀酰化和去丙二酰化的活性，广泛参与代谢途径酶的调控。
景杰生物和北京大学尚永丰院士、俞文华教授合作报道另一个去琥珀酰化酶SIRT7【7】，该酶在表观遗传学水平，调控组蛋白的琥珀酰化，进而影响基因组的稳定性。
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关键词：
琥珀酰化、去琥珀酰化、SIRT5、SIRT7、p300、CPT1A/Carnitine Palmitoyltransferase 1A
研究思路与结果:
琥珀酰转移酶首先需要有CoA结合的能力，作者首先在Swiss-Prot数据库中筛选到33个具有CoA结合特征的蛋白，然后在酵母中异源表达进行验证，目标锁定在9个候选蛋白，这其中就有CPT家族成员（图 1）。已知肝脏中蛋白维持比较高的琥珀酰化水平，而CPT1A又是在肝脏中高表达的isoform，因此作者在体外验证CPT1A琥珀酰转移酶活性。
图1. 通过酵母体外筛选体系筛选潜在的赖氨酸琥珀酰转移酶
在293T细胞中过表达CPT1A会显著增加胞内蛋白的琥珀酰化水平（图 2 A），利用景杰公司提供的琥珀酰化SILAC定量蛋白质组学（图 2 B），在CPT1A过表达细胞系中，鉴定到101个琥珀酰化水平显著增加的蛋白（cutoff>1.5）,其中有近半数的蛋白定位于细胞质中。并且也证明琥珀酰化水平增加并不是琥珀酰辅酶A的含量增加，或去琥珀酰酶依赖的NAD+辅酶降低导致。
图2. 利用SILAC定量蛋白质组学鉴定到潜在的，受CPT1A琥珀酰化修饰的底物蛋白
乳腺癌细胞系T47D中高表达CPT1A基因，为了研究该基因的功能，作者利用RNAi对该基因进行knockdown。结果表明KO的细胞中，蛋白琥珀酰化水平显著降低。利用景杰公司提供的琥珀酰化SILAC定量蛋白质组学，在CPT1A-KO的T47D细胞系中，鉴定到156个琥珀酰化水平显著降低的修饰位点（cutoff>1.3）（图 3A）。CPT1Ａ H473突变体丧失和酰基辅酶Ａ结合的能力，体外实验也表明该突变体丧失乙酰化enolase1的能力。随后的对enolase1鉴定的琥珀酰化位点进行点突变，体外CPT1A体外酰化实验表明，K80/81和K335位点是琥珀酰化调控enolase1活性的关键位点。因此上述研究表明CPT1A通过琥珀酰化修饰对蛋白活性调控的重要角色。
图3. CPT1A Knockdown的细胞中，鉴定到156个受调控的位点。在众多底物中，enolase1活性受琥珀酰化修饰的抑制
研究人员利用点突变，寻找CPT1A中只影响其琥珀酰化活性的关键位点。和CPT1A H473A丧失所有酰化活性不同（酰基辅酶A结合的关键位点），CPT1A G710E突变体丧失其carnitine palmitoyltransfererase的活性，但是对其琥珀酰化活性影响不大。表明该位点对CPT1A琥珀酰化转移酶活性而言非常重要（图 4）。有研究表面谷氨酰胺代谢抑制的乳腺癌细胞中，enolase1的KD会延长细胞生存。作者的研究表明，这和CPT1A琥珀酰化enolase1，抑制其活性有关。暗示琥珀酰化在细胞生存调控中的重要作用。
图4. CPT1A G710E突变体只丧失其carnitine palmitoyltransfererase的活性，但是对其琥珀酰化活性影响不大
参考文献：
1. Kiran Kurmi, et al. (2011), Carnitine palmitoyltransferase 1A has a lysine succinyltransferase activity. Cell Reports 22, 1365–1373.
2. Zhihong Zhang, et al., (2011), Identification of lysine succinylation as a new post-translational modification. Nat. Chem. Biol. 7, 58-63.
3. Jeongsoon Park, et al., (2013), SIRT5-Mediated lysinedesuccinylation impacts diverse metabolic pathways. Mol. Cell. 50, 919-930.
4. Yugang Wang, et al. (2017), KAT2A coupled with the α-KGDH complex acts as a histone H3 succinyltransferase. Nature 552, 273-277.
5. Chao Peng, et al., (2011),The first identification of lysine malonylation substrates and its regulatory enzyme. Mol. Cell. Proteomics 10, M111.012658.
6. J. Du, et al. (2011), Sirt5 is a NAD-Dependent protein lysine demalonylase and desuccinylase. Science 334,806-809.
7. Lei Li, et al. (2016), SIRT7 is a histone desuccinylase that functionally links to chromatin compaction and genome stability. Nat. Communication.
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