“失之东隅，收之桑榆” RPL10L对X染色体RPL10基因在减数分裂中失活的补偿效应
景杰编者按：哺乳动物的性染色体是从祖先的常染色体进化而来。在漫长的进化过程中，性染色体发生复杂变化。其中，雄性减数分裂过程中，经历基因的转移和重新分配，X染色体收获了特殊技能。很多retrogenes（逆转座基因）起源于X染色体，在基因组中所占的比例远远高于起源于常染色体的比例。这些逆转座基因从哪来？其生物学意义是什么？正是研究人员一直想回答的问题。
早在2002年，芝加哥大学龙漫远教授报道retrogenes偏向离开X染色体，转移到常染色体中，他推测这种现象是对X染色体失活的补偿效应【1】。目前认为这种现象和减数分裂性染色体沉默（Meiosis sex chromosome inactivation, MSCI）有关。MSCI的进化压力驱动了X染色体上的基因逆转座到常染色体上。但该假说一直在实验上未能进行验证。
日前，中国科学技术大学史庆华教授课题组在著名期刊Current Biology发表文章，在小鼠上验证了15年前龙漫远教授的推测。RPL10L是位于小鼠常染色体并在睾丸中特异表达的retrogene，它的前体是X染色体上一个核糖体蛋白编码基因RPL10。通过和景杰生物合作，研究人员利用高通量定量蛋白质组学技术，分析了Rpl10I-/-和 Rpl10l+/+小鼠中核糖体蛋白的差异，证实Rpl10l能够补偿MSCI导致的Rpl10转录沉默以保证正常的精子发生，为基于MSCI的retrogenes补偿假说提供了直接的实验证据【2】。
除了retrogenes外，表观遗传修饰也是一种近期被关注的，解释补偿假说的理论。2010年，芝加哥大学赵英明教授在Cell上报道了一种全新的蛋白质翻译后修饰：组蛋白巴豆酰化修饰，同时证明该修饰在突破X染色体基因抑制中发挥了重要的调控作用【3】，因此关于X染色体上基因补偿假说，还有很多方向，尤其是组蛋白翻译后修饰，值得研究人员关注。
关键词：RPL10，RPL10L，逆转座基因，性染色体沉默，补偿假说
研究思路和成果：
研究人员利用CRISPR/Cas9的方法制备了Rpl10l敲除小鼠（Rpl10l+/-代表杂合突变，Rpl10l-/-代表纯合突变），并外源导入Rpl10l补偿内源敲除，利用荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光染色、定量蛋白质组分析详细研究它们的表达模式、分子功能及作用方式，以期深入了解X染色体来源的retrogenes存在的意义及其进化机制。
首先检测了人和小鼠不同组织和细胞系中Rpl10l的表达，q-PCR和Western blot结果发现Rpl10lm-RNA和Rpl10l蛋白在人和小鼠睾丸中特异表达（图1）。Rpl10l+/-杂合小鼠睾丸及附属睾丸大小及精子数目与野生型小鼠没有显著性差异，但是Rpl10l-/-敲除小鼠睾丸形态和体重明细减少，且附睾中没有精子，组织切片染色结果一致（图 1）。表明Rpl10l敲除导致小鼠精子发生失败且丧失生育能力。
图1. RPL10L在小鼠睾丸中特异表达且与精子发育相关。和野生型相比，Rpl10l-/-小鼠睾丸发育异常
研究人员发现Rpl10l敲除导致了第一次减数分裂停滞（图2A），为了检测敲除小鼠中精子发生停滞的具体时期，作者对精母细胞前期Ｉ进程进行分析，发现Rpl10l敲除不影响精子发育过程中精母细胞前期I的进程（图2BC）。随后，对精母细胞前期I向中期I的转换染色和计数分析（图2C, D），发现统计结果显示与 Rpl10l+/-小鼠睾丸细胞相比，敲除小鼠睾丸细胞滴片上没有发现MMＩＩ细胞,且只有少量MMＩ细胞，Rpl10l敲除会导致精母细胞前期Ｉ向中期Ｉ的转换失败。
图2.Rpl10l敲除导致第一次减数分裂失败
为了探索究竟Rpl10l突变是如何导致精子发生失败，研究人员和景杰生物合作，利用其高通量定量蛋白质组学平台，对粗线期和双线期的Rpl10l+/+和Rpl10l-/-细胞全蛋白组进行TMT定量分析。定量到3100个蛋白，敲除后细胞样本中1.3倍上调蛋白368个，对应下调蛋白445个。进一步对核糖体进行分析发现发现69个核糖体蛋白被定量，其在敲除中67个蛋白在Rpl10l-/-敲除鼠粗线期和双线期精母细胞中含量降低，且30个降低倍数超过1.3倍（图 3），并且Western blot证实相关核糖体蛋白含量变化（图3 ）。结合蛋白组学结果，可以说明Rpl10l蛋白对小鼠粗线期及双线期精母细胞中的核糖体生成至关重要，它的缺失将导致细胞中核糖体数目下降，进而导致细胞内大量蛋白的变化并致使减数分裂进程受阻和精子发生失败。
图 3. Rpl10l-/-敲除鼠中核糖体蛋白显著下调
左图，定量蛋白组坚定到的下调的核糖体蛋白
右图，Western实验的验证
接下来作者通过一系列实验验证了Rpl10在减数分裂性染色体失活过程中发生转录沉默，通过敲低Rpl10的mRNA水平进一步发现Rpl10敲低会破坏细胞中核糖体生成，并导致Ｇ１期细胞周期停滞。这与Rpl10l敲除鼠在粗线期和双线期精母细胞中结果一致。
根据补偿学说，Rpl10l应该会在Rpl10转录沉默的细胞中特异表达。作者巧妙的设计了一个补救实验，实验组将EGFP、Rpl10-EGFP、Rpl10l-EGFP表达载体与靶向RPL10的CRISPR/Cas9共转染，而对照组则是与无义的Rpl10-EGFP共转染。结果表明293T细胞系中导入外源Rpl10l蛋白能够替代内源Rpl10蛋白，维持细胞正常增殖和存活（图4），意味着他们具有相同的并且可以替换的分子功能。
图4.外源Rpl10l补偿了Rpl10在精子发生中的转录沉默
那么，这是否意味着Rpl10同样能挽救RPL10L敲除小鼠的精子发生和生育力？
作者成功构建了Rpl10转基因的RPL10ll敲除小鼠，雄性Rpl10-mCherryTG小鼠与雌性敲除小鼠进行杂交的2代小鼠进行试验，结果如图5，结果充分说明Rpl10-mCherryTG转基因小鼠可以重建Rpl10l敲除小鼠的精子发生和生育力。
总结：作者通过构建Rpl10l敲除小鼠发现RPL10L在小鼠睾丸中特异表达且与精子发育相关。利用高通量蛋白质组学分析进一步揭示Rpl10l缺失将导致细胞中核糖体数目下降，进而导致细胞内大量蛋白的变化并致使减数分裂进程受阻和精子发生失败机制。通过细胞水平的回补实验，证实外源Rpl10l蛋白能够替代内源Rpl10蛋白维持细胞正常增殖和存活，补偿了Rpl10在精子发生中的转录沉默。以此为依据构建了Rpl10转基因的RPL10l敲除小鼠，证实可以重建Rpl10l敲除小鼠的精子发生和生育力。Rpl10l蛋白能够补偿MSCI过程导致的Rpl10蛋白的不足，以保证正常的精子发生，这也为Ｘ染色体起源的retrogenes补偿假说提供了直接的实验证据，并且支持MSCI是Ｘ染色体向常染色体上产生大量retrogenes的进化压力。
于此同时，大量研究表明MSCI广泛存在的表观遗传调控，如histone的酰化修饰、甲基化等修饰，因此组蛋白修饰在补偿效应中的角色还有待研究人员去发掘。景杰生物作为全球蛋白质组学技术的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学（磷酸化、乙酰化、巴豆酰化、琥珀酰化、二羟基异丁酰化、丙酰化、丁酰化、丙二酰化等）研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作，与您一起探索生命的奥秘。
参考文献：
1. Esther Betran, et al., (2017), Retroposed New Genes Out of the X in Drosophila, Genome Research 12,1854-1859.
2. Long Jiang, et al.,(2017), RPL10L Is Required for Male Meiotic Division by Compensating for RPL10 during Meiotic Sex Chromosome Inactivation in Mice，Current Biology 27, 1-8.
3. Mingjia Tan, et al., (2011), Identification of 67 HistoneMarks and Histone Lysine Crotonylation as a New Typeof Histone Modification. Cell 146, 1016-1028.
通讯作者简介：
史庆华博士，中国科学技术大学教授，博士生导师，合肥微尺度物质科学国家科学中心PI；中国科学院“百人计划”引进人才；国家杰出青年基金获得者；国家重大科学研究计划项目“卵泡发育的分子调控”和国家重点研发计划项目“人类配子发生、成熟障碍和胚胎停育的分子基础”首席科学家；曾任科技部国家重大科学研究计划专家组专家。
近10年来，以第一或通讯作者在Nature、American Journal of Human Genetics、Nucleic Acids Research、Bioinformatics、Cell Research和Current Biology等杂志上发表SCI论文60余篇，被他人引用2000余次。
景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。