磷酸化蛋白质组学揭示ADP在血小板活化调控中的分子机制

景杰编者按：

腺苷二磷酸(ADP)可以激活血小板，促进血小板聚集而形成血栓。研究表明ADP通过特异性结合G蛋白偶联膜受体P2Y1和P2Y12，引起细内的信号级联反应从而激活整合素aIIbβ3，最终导致血小板聚集。相反，内皮细胞前列环素可以抑制血小板的活化而阻止血栓的形成。为了揭示血小板聚集的关键机制以及发现新的抗血小板的分子靶标，来自德国的研究人员通过磷酸化组学方法分析了ADP介导的血小板内信号通路的变化。同时，研究人员使用伊洛前列腺素（Iloprost）拮抗ADP所介导的血小板的活化，以模拟内皮细胞前列环素的抗血小板过程。相关研究成果发表在著名的学术期刊Blood。景杰生物作为全球蛋白质修饰抗体开发和蛋白质组学技术的开拓者与领跑者, 通过和全球科研人员的深度合作，在蛋白质修饰组学研究领域不断推陈出新，极大地推动了相关研究的进展。景杰生物可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案。

关键词：

ADP，磷酸化组学，伊洛前列腺素，血小板活化，PRM

研究思路和成果：

本研究使用20 µM 的ADP对健康人的血小板进行处理（三个时间点10s，30s，60s）。随后的磷酸化修饰组学分析共获得3952个磷酸化修饰位点（1600个蛋白）的定量信息，其中436个磷酸化修饰位点（302个蛋白）具有两倍以上的差异。值得注意的是，10s刺激就可引起绝大部分磷酸化修饰位点（375个位点／253个蛋白）的早期响应（图1），延长处理时间对磷酸化修饰诱导不明显。在早期响应的磷酸化蛋白中，几乎一半的蛋白会呈现持续性的上调或下调；其他的蛋白则在30s后恢复至刺激前的正常水平。

图1. ADP刺激引起的蛋白磷酸化的变动趋势

富集分析显示大部分信号通路的蛋白的磷酸化修饰水平在刺激10s后达到最大值，随后持续降低。然而，在酪氨酸受体激酶和酶偶联受体介导的信号通路中，蛋白的磷酸化修饰水平在10s刺激后达到最高值，30s刺激后显著性下降，60s处理却升高了（图2）。这可能是由于两种激酶／磷酸酶磷酸化通路被激活时期不同引起的： 早起阶段（10s刺激）的磷酸化修饰的变化由ADP-受体介导；而后期阶段的磷酸化修饰变化依赖于内部整合素信号通路。

图2. ADP刺激后信号通路的变化模式

为了考察内皮细胞前列环素的抗血小板过程，研究人员使用了Iloprost以拮抗ADP所介导的血小板的活化。在20 µM ADP处理血小板30s后，用2nM的Iloprost进行处理30s和60s。随后的磷酸化修饰组学分析共鉴定到3568个磷酸化位点（1141个蛋白），其中224个磷酸化位点具有显著性差异。在对ADP刺激以及Iloprost抑制处理获得的可定量磷酸化位点进行分类，可得到三类： 不受Iloprost 影响的磷酸化位点；Iloprost 处理后表达水平下降的磷酸化位点；Iloprost 处理后表达水平上升的磷酸化位点（图3）。作者重点专注Iloprost处理后磷酸化水平发生强烈变化或瞬时变化的位点，因为这些位点可能是逆转血小板激活的潜在靶点。这些潜在靶点可能包括磷酸化水平显著上调PKA下游底物，以及磷酸化水平发生反转的细胞骨架重组蛋白MYO9B, SLAIN2, ROCK2, FLNA,SSFA2和TMSB4X。

图3. ADP+Iloprost处理后磷酸化修饰的应答模式

对这些磷酸化位点进行聚类分析后发现：ADP刺激持续上调但不受Iloprost影响的磷酸化蛋白包括膜蛋白HMHA1 ，F11R和SCARF1等，它们是PKC的底物（图4B）； ADP刺激会下调或者不变但Iloprost处理后上调的蛋白包括PKA底物RASGRP2等（图4C）；ADP刺激会上调但Iloprost处理后显著下调的蛋白包括ENSA, G6B, RASGRP2 SHROOM4和DNM2。

图4. ADP1+Iloprost处理后磷酸化位点的聚类分析

由于缺乏位点特异性的磷酸化抗体，作者采用靶向蛋白组学PRM（Parallel Reaction Monitoring ）的方法，对筛选到的关键修饰位点进行验证。作者共检测了研究中涉及的7个实验组中的23个磷酸化修饰位点，相当于做了805次的免疫印迹试验(Western Blots)。结果显示，PRM分析结果和磷酸化修饰组学数据具有很好的一致性（图5）。

图5. PRM分析对23个磷酸化修饰位点的验证

综上所述，研究人员通过磷酸化修饰组学的方法研究血小板ADP和 ADP+Iloprost处理后不同时间点的磷酸化水平变化。一方面有利于我们揭示血小板激活及抑制过程中新的分子机制；另一方面，磷酸化修饰水平在ADP激活及Iloprost抑制血小板活化过程中发生反转的位点/蛋白有助于开发临床上监控血小板的新靶点。

参考文献：

Florian Beck , et al., 2017, Temporal quantitative phosphoproteomics of ADP stimulation reveals novel central nodes in platelet activation and inhibition. Blood 2017 129:e1-e12.

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