磷酸化组学揭示T细胞激活后的信号通路和代谢途径的动态变化

景杰编者按：

蛋白质的磷酸化修饰是目前为止研究最为深入也最为广泛的一种翻译后修饰形式之一，它在多种生物学事件中发挥关键作用。今天给大家介绍的这篇文章来自于美国St. Jude儿童研究医院迟洪波教授、彭军明教授合作的成果，利用磷酸化组学技术研究T细胞激活后的信号和代谢通路^[1]。

文章通过蛋白质组学和磷酸化组学发现了导致T细胞静息状态改变的信号网络和代谢途径，阐明了TCR可以激活相互关联的一些功能模块，如激酶和转录因子，这些模块在T细胞激活过程中都发挥了关键的调控作用；另外，借助组学分析还发现，复合物mTORC1和TCR的相互作用对线粒体的核糖体生物合成和复合物IV的生物活性都具有很重要的调控作用，而后者们在T细胞激活后的代谢调控中起着关键作用；文章进一步还发现线粒体酶COX10介导的氧化磷酸化无论是在体内还是体外都对T细胞的激活至关重要。

实际上，关于磷酸化修饰的研究非常的广泛，迄今为止，已有很多文章报道了它在各个研究领域的应用。

磷酸化修饰广泛参与细胞内信号通路的调控。2013年，朱健康院士课题组在PNAS上报道，通过磷酸化修饰组学技术比较了野生型和snrk2.2/2.3/2.6突变型的拟南芥种子磷酸化修饰蛋白的差异，再结合体外激酶实验筛选出蛋白激酶SnRK2s下游的作用底物，发现这些底物蛋白参与开花时间调控，miRNA和表观遗传调控，信号转导等进程^[2]。

磷酸化修饰还参与生物发育过程的调控。2016年，景杰生物与韩国科学家合作，通过磷酸化修饰组学技术研究了斑马鱼胚胎发育过程中蛋白质磷酸化水平的变化，根据受精后不同时期中蛋白质磷酸化的持续变化，将480个不同通路中的磷酸化蛋白归成6大类，为今后斑马鱼胚胎的磷酸化研究提供了参考^[3]。

磷酸化修饰还与病原体侵染过程相关。2017年国际著名期刊Cell Host & Microbe研究报道，通过磷酸化修饰组学技术分析了新型隐球菌（Cn）侵染宿主初期激酶网络的变化情况，发现mTOR、STK11/LBK1和 AMPK/AIC信号通路的剧烈变化。通过体内体外模型的功能实验证明，AMPK/AIC信号通路是Cn侵染宿主、病菌复制和引发病理变化的驱动因素，不仅为研究真菌与宿主互作机制提供了重要的数据资源，更为相关疾病的治疗寻找到了潜在的药物靶点^[4]。

磷酸化修饰在生物节律调控过程中也发挥关键作用。2016年，国际知名期刊Cell Metabolism上的研究报道，通过磷酸化修饰组学技术分析小鼠肝脏组织核蛋白表达谱及磷酸化修饰谱，证实一系列核蛋白复合体的蛋白表达水平或磷酸化修饰水平受到昼夜节律动态调控，这些复合体参与了转录调节、DNA损伤修复、核糖体的生物合成、细胞周期、染色体多倍性等多种生物学过程^[5]。

磷酸化修饰在细胞周期中也发挥作用。2016年，Cell发表研究性文章指出，基于磷酸化修饰组学分析检测裂殖酵母CDK底物的磷酸化水平，发现在细胞周期中不同CDK底物的磷酸化与细胞处于何种细胞分裂阶段有着密切关联。细胞分裂受到细胞周期蛋白-CDK活性阈值及底物特异性的共同的精细调控^[6]。

磷酸化修饰在药物作用过程中发挥作用。去年，德国慕尼黑理工大学的研究者在国际著名期刊Cancer Research上发表论文，采用蛋白质组学和磷酸化修饰组学综合分析了拉帕替尼敏感和耐药细胞系中的蛋白质和磷酸化变化，发现AKT信号通路和糖酵解过程在耐药细胞系中发生显著改变，并可以作为针对性的治疗靶标^[7]。

磷酸化修饰参与细胞分化调控。2017年，EMBO Journal上一篇文章表明，通过对表皮祖细胞分化前后的磷酸化修饰水平进行定量比较，发现磷酸化修饰水平变化最显著的是与细胞黏着相关的桥粒蛋白（desmosome proteins），其中桥粒蛋白PKP1的磷酸化水平又受激酶RIPK4的调控，且在细胞分化后显著上调。更为重要的是，细胞和动物模型实验表明，Pkp1或Ripk4的缺失都会破坏表皮正常分化，诱发表皮癌变^[8]。

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关键词：

磷酸化   信号通路    免疫   

研究思路与结果：

在适应性免疫过程中，位于胸腺中的T细胞存在两种状态，一种是静息状态，一种是激活状态，两种状态之间的转变受到复杂而精细的调控作用。抗原的刺激是比较常见的一种调控。在抗原刺激时，T细胞表面的T细胞受体TCR可触发一系列信号级联反应，最终导致白细胞介素2（IL-2）和细胞表面受体的积累，促进细胞生长和增殖，并最终分化成效应细胞。然而，关于这个过程中发生了哪些具体的信号变化和通路变化至今还未得到阐明。有研究表面，线粒体的氧化磷酸化可促进T细胞激活，而T细胞激活后又会上调线粒体的氧化磷酸化，进而影响线粒体的功能，进一步导致T细胞的增殖受到影响。然而，其具体的过程和信号网络还不得而知。

为了深入研究这一变化过程中的具体机制，这篇文章对不同刺激阶段的T细胞进行了多组学分析。由于转录水平往往很难预测实际蛋白水平的变化，尤其是线粒体氧化磷酸化过程引起的蛋白磷酸化水平的变化更是难以检测，因此作者采用了蛋白组学和磷酸化组学结合的方式进行了研究。

首先，作者通过构建TCR刺激的小鼠模型，选择未刺激和TCR刺激2h、8h和16h的T细胞作为实验样本，同步进行基于高通量的蛋白组学和磷酸化修饰组学研究，分别鉴定到8431个蛋白和13755个磷酸化肽段（图1A）。为了验证组学结果，作者采用western-blot的方法分别检测了TXNIP和PDCD4的表达量，以及PDHA-1和CAD的磷酸化变化情况，发现其与组学结果保持高度一致（图1B和C）。

图1. 实验设计及验证

此外，为了排除取样时不同样本和样本本身变化的影响，作者还进行了统一处理不同样本和同一样本不同处理的数据关联分析，发现其带来的误差都是随机性分布的，从而排除了取样和样本自身对实验结果产生影响的可能性。值得一提的是，由这些分析可以看出，磷酸化的变化情况相对蛋白质来说是比较大的，这可能是由于磷酸化在体内的快速变化导致的。进一步的主成分分析和聚类分析都证明了该结果的可靠性。

在初始T细胞激活过程中，翻译水平上的调控比转录水平上的调控对胞内蛋白变化影响更大。本文作者也做过T细胞刺激8h后的蛋白与mRNA水平上的分析，发现两者的相关性很差，当以1.5倍作为差异时，仅有很小的一部分保持一致。这些结果都说明在TCR刺激后的T细胞激活过程中，存在独特的分子调控网络来调节胞内蛋白的变化。为了进一步研究其蛋白动态变化的模式，作者又对鉴定到的8431个蛋白进行了ANOVA的差异表达分析，共找到1712个差异表达蛋白，再将行使相似生物学功能和调控机制的高度相关的差异表达蛋白依据共表达聚类WGCNA分析，分为6个大类，分别是WPC1-6，分析得到了每一类中与T细胞激活密切相关的调控通路，功能注释分析显示IL-2和TNFa信号通路在其中起着关键的作用（图2）。

图2. 蛋白组数据聚类分析和功能注释分析

接着，作者又对上述6大类进行了蛋白互作网络分析，将其分为90个功能模块，这里的模块是指系统级的功能单元，可以相互交互以形成模块级的网络。每个模块含有的蛋白数基本都在2-56个之间，其中80个模块是由WPC3类中的蛋白组成，最大的一个模块主要包含WPC3中的核糖体蛋白，这表明了T细胞活化时其功能调控的一致性。由此数据也可以看出，通过组学的分析手段是发现很多未知功能模块的一个有效方法，例如关于蛋白酶体意外激活的43号模块就是这样发现的。进一步的分析还发现了TCR刺激导致的6个线粒体信号通路的变化。

采用同样的方法，作者还分析了磷酸化修饰组学获得的数据，找到3280个差异磷酸化肽段，7个共表达聚类PPC1-7，34个激活的激酶，并利用时间数据和IKAP推断的激酶活性，重构了激酶信号网络（图3），这些数据都表明，TCR刺激T细胞后，AKT-mTOR和GSK3分别作为T细胞激活的正、负调节剂在磷酸化蛋白质组的动态重构中发挥着关键调控作用。

图3. 磷酸化组学的聚类分析和构建的激酶网络

为了准确地预测T细胞激活过程中的转录因子及激酶活性变化情况，作者将蛋白组和转录组数据进行整合分析，发现了56个与激活相关的转录因子，通过蛋白组和磷酸化组学的数据验证得到了30个激活转录因子，再依据公共数据库中已知的转录因子和激酶关系网络筛选得到19个激酶。最终构建了T细胞激活过程中含30个激酶和19个转录因子的网络（图4）。通过复杂的分析，文章确定了与T细胞激活过程中转录、翻译和翻译后修饰调控相关的转录因子和激酶。

图4. 蛋白组、转录组和磷酸化组学数据的整合分析

经上述组学分析发现，mTOR信号通路在TCR刺激T细胞活化过程中发挥关键作用，为了进一步研究其如何发挥作用，作者突变了其中的关键因子Raptor，然后选择突变前后的细胞进行与上述一样的蛋白质组和磷酸化组学分析，共鉴定到9178个蛋白和10159个磷酸化多肽，结合一系列相似的生物信息学分析，最终发现mTORC1在该过程中是一个关键的负调控因子，可以在TCR刺激T细胞后在转录、翻译和翻译后修饰水平上通过激活线粒体的功能代谢来调控相关的免疫和代谢通路。

为了进一步研究涉及到T细胞激活的具体的线粒体途径和上游信号，作者结合免疫荧光、流式细胞及一些生化指标的测定，分别确认了线粒体上的核糖体、COX10（一种有利于复合物IV表达和组装的辅助因子，在T细胞激活中发生上调）、HK2（糖酵解过程中的关键限速酶）三种分子在T细胞激活过程中的关键作用，发现TCR刺激T细胞后，COX10是初始T细胞进入细胞周期，增殖并长期存活的关键。进一步通过敲掉COX10的小鼠，发现COX10是TCR刺激T细胞后，T细胞增殖分化形成Th1细胞并参与抗细菌免疫反应的关键。

结论：

本文通过对TCR刺激后的T细胞进行蛋白组学和磷酸化组学分析，结合公共数据库中的转录组数据分析，从多组学的层面上对T细胞激活后的分子调控网络进行研究，找到了多个关键的功能模块、激酶和调控蛋白，结合一些生化分析实验最终验证了复合物mTORC1和TCR通过彼此之间的相互作用对线粒体的核糖体生物合成和复合物IV的生物活性进行调控，进一步调控T细胞激活后的代谢过程；敲除实验和生化分析还证实线粒体酶COX10介导的氧化磷酸化无论是在体内还是体外都对T细胞的激活至关重要。整个文章从总体层面对T细胞激活后的蛋白变化情况和磷酸化的动态变化进行了分析，为后续研究提供了很好地方向，也为进行类似研究提供了一个很好的借鉴。

参考文献：

1. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity (2017).

2. Quantitative Phosphoproteomics Identifies SnRK2 Protein Kinase Substrates and Reveals the Effectors of Abscisic Acid Action. PNAS, 2013.

3. Global Analysis of Phosphoproteome Dynamics in Embryonic Development of Zebrafish (Danio rerio). Proteomics, 2016.

4. Global Reprogramming of Host Kinase Signaling in Response to Fungal Infection. Cell Host & Microbe, 2017.

5. Nuclear Proteomics Uncovers Diurnal Regulatory Landscapes in Mouse Liver. Cell Metabolism, 2016.

6. CDK Substrate Phosphorylation and Ordering the Cell Cycle. Cell, 2016.

7. Lapatinib Resistance in Breast Cancer Cells Is Accompanied by Phosphorylation-Mediated Reprogramming of Glycolysis. Cancer Research, 2017.

8. Phosphorylation of Pkp1 by RIPK4 Regulates Epidermal Differentiation and Skin Tumorigenesis. EMBO Journal, 2017.

景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。