泛素化组学揭示VCP底物蛋白与维持细胞稳态性途径
含缬酪肽蛋白(Valosin-containing protein, VCP)又名P97，是进化保守的泛素化依赖性的AAA+ ATPases，通过adaptor蛋白与泛素化蛋白形成复合物，参与蛋白的remodeling和泛素化降解，具有维持细胞的稳态性等多种功能。然而尽管VCP在蛋白降解与重塑中的重要性，但人们对其底物的蛋白种类及特性知识知之甚少。
常规泛素化存在很难使用底物特异性抗体去鉴别其修饰情况和修饰位点的难题，而泛素化修饰组学能够很好的解决这一困难。最近，来自德国的研究人员利用泛素化蛋白组学，鉴定了450个VCP的底物蛋白。研究发现很多蛋白参与基因表达调控，DNA修复，细胞周期等生物过程，同时还发现VCP参与调控重要转录因子c-Myc的降解。相关研究发表在著名学术期刊EMBO reports【1】。
关键词：VCP; c-Myc; HUWE1; K6位泛素化；泛素化修饰组学
含缬酪肽蛋白(Valosin-containing protein, VCP/p97，是进化保守的依赖泛素化的AAA+ ATPases，已知人的活性p97是六聚体。底物蛋白被泛素化体系（E1/E2/E3）泛素化后，在adaptor蛋白的帮助下，p97识别泛素化分子对泛素化的底物蛋白进行解折叠，然后要么被蛋白酶体降解，要么被DUB去泛素化，实现recycling（图 1）。
图 1，AAA+-ATPase VCP/p97和其在泛素化途径中的作用。
VCP本身没有识别泛素化的结构域，是通过与包含泛素化结合区域伴侣蛋白与底物互作。VCP主要已知一些伴侣蛋白包括ubiquitin-X（UBX）或结合在VCP蛋白N端的UBX-like区域。目前VCP研究主要是在内质网相关的降解过程，主要是对内质网中错误折叠的蛋白进行转移向蛋白酶体进行降解。此外VCP也参与通过溶酶体自噬途径对蛋白质聚集体（protein aggregates），应激颗粒(stress granules)和细胞器的降解。随着研究深入也发现VCP介导的蛋白重塑也会涉及到细胞的其他器官如细胞核，线粒体外膜，而这些调节蛋白的重塑却也并非与蛋白质降解有关。
研究人员首先利用SILAC技术对骨瘤细胞U2OS进行培养标记，采用VCP抑制剂NMS-873，蛋白酶体抑制剂MG132处理后，对泛素化蛋白进行质谱鉴定（图 2）。WB实验表明，VCP和蛋白酶体抑制剂后，蛋白的泛素化修饰水平都有上升。蛋白酶体受到抑制后的泛素化修饰较VCP被抑制更明显。研究人员通过增加VCP抑制剂浓度，泛素化修饰水平并没有发生继续增加，表明VCP对泛素化修饰的改变是有选择性。
随后研究人员进行了泛素化修饰组学的定量分析。鉴定比较VCP和蛋白酶体之间对底物修饰的异同。在VCP抑制剂NMS-873处理后样本鉴定到了7464个双甘氨酸修饰位点的蛋白，其中63%和40%的修饰蛋白位点是分别在2或3个重复中鉴定到。抑制蛋白酶体后，45%泛素化位点修饰水平增加；而VCP抑制处理后，导致16%的修饰位点丰度位点增加。
图2 VCP抑制后导致细胞的泛素化修饰普遍增加。
VCP抑制后，在泛素化修饰丰度增加两倍的25个蛋白主要涉及到未折叠蛋白应答（unfolded protein response）。涉及到非降解（non-degradative）的泛素化蛋白有核心组蛋白和核糖体蛋白，它们在VCP被抑制后的泛素化水平下调。
研究人员对7种泛素化链接模型进行了分析，其中VCP抑制剂NMS-873在处理6小时后，K6位泛素化修饰蛋白丰度较蛋白酶体抑制剂MG132处理后高4.6倍。为了证实这种现象不是由于泛素化池增加而导致的间接影响，研究人员观察到K6位泛素化在VCP抑制剂NMS-873处理30min依然表现增高，而这个时间点游离的泛素化多肽没有发生变化。
由于K6位泛素化调节研究仅仅停留在泛素化连接酶parkin在自噬中自噬反应的报道【2】。研究人员结合VCP被抑制后的K6位泛素化修饰蛋白质谱鉴定结果发现83个在四个重复中持续性出现的蛋白，这些蛋白涉及到受体胞吞（receptor endocytosis），细胞周期，ERAD途径或蛋白酶体降解的功能。比较泛素化修饰、K6位泛素化质谱结果，发现K6位泛素化蛋白是发生在VCP抑制后而不是蛋白酶体抑制后。作者采用泛素化位点替代的方法证实了K6位泛素化存在于ARL2，DCAF7，DNAJB2，HGS，和STAM2等蛋白中。
对pull down显著富集的HECT-E3ligase HUWE1 knockdown，导致K6位泛素化修饰降低两倍以上，证实HUWE1的确是主要作用于蛋白的K6位泛素化。
随后，研究人员对泛素化修饰组学中鉴定到的VCP底物蛋白进行了分析。VCP被抑制后质谱鉴定分析鉴定了806个上调和636个下调的泛素化位点（P<0.01）。而蛋白酶体抑制后鉴定的差异位点远远大于VCP抑制（2120个上调和和977 个下调） （图 3）。研究人员通过生物信息学的方式对这些蛋白的结构和生化特性进行了分析和预测。分析结果表明VCP底物具有较高比例的a-helices二级结构，还具有较低的复杂性和非稳定性区域，较高的疏水性结构特点。
图3 泛素化修饰组学鉴定VCP底物
最后，研究人员挑选依赖于VCP蛋白酶体降解的底物c-Myc（K148）进行验证。 VCP抑制处理后也同样能增加外源表达的c-Myc，共聚焦显微镜观察到內源的c-Myc表达水平上升主要定位在细胞核內。研究人员通过c-Myc-GFP进行 IP质谱鉴定了许多互作蛋白，如Max，VCP。在质谱鉴定的互作蛋白中，E3连接酶HUWE1被报道过调节c-Myc泛素化。研究人员随后证实了VCP是从高度结构化的c-Myc-Max异源二聚体的染色质中提取出c-Myc并通过蛋白酶体降解，从而实现了对基因表达的调控 （图4）。
图4 VCP对转录因子c-Myc的调控。
C-Myc和Max二聚体结合到染色质，启动基因表达。HUWE1对c-Myc的K148泛素化导致VCP结合，之后导致c-Myc的解离，进入蛋白降解途径。
本研究采用SILAC技术和泛素化残基对VCP抑制后进行了高通量的泛素化修饰丰度及位点鉴定。鉴定和定量到了806个上调和636个下调的泛素化位点。筛选到了456各VCP候选底物，功能主要涉及调控基因表达，DNA修复和细胞周期。通过与蛋白酶体抑制后的泛素化修饰比较，筛选到119个不依赖于蛋白酶体的调控途径底物。发现VCP抑制后特异性增加的K6位泛素化修饰，主要是通过HECT型泛素化连接酶HUWE1识别。 证实了VCP通过新型的底物转录因子c-Myc调控细胞基因表达。
泛素化修饰组学能够很好的解决泛素化很难使用底物特异性抗体去鉴别其修饰情况和修饰位点的难题，将VCP底物一网打尽，因此调控机制尽收眼底。
参考文献：
1. Herdelberger J, et al. Proteomic frofiling of VCP substrates links VCP to K6-linked ubiquitylation and c-Myc function. EMBO Rep., 2018.
2. Ordureau A, et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proc Natl Acad Sci USA, 2015.
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