乙酰化修饰组学揭示致病真菌抑菌新机制
研究关键词：皮肤癣菌, 红色毛廯菌, 蛋白质组学，label-free，赖氨酸乙酰化，PRM
编者按
脚癣是一种极具传染性、极难根治的皮肤浅部真菌病，红色毛廯菌是其主要病原菌。当红色毛廯菌休眠的分生孢子黏附到宿主后，开始发芽长出菌丝纵向进入皮肤，从而引起皮肤损伤，引发脚藓。
由于红色毛廯菌的组织渗透不足及脱靶效应，目前还没有很有效的抗真菌治疗手段。为了探究红色毛廯菌在休眠孢子期、菌丝生长期两个生长阶段生物学特性的差异，中国医学科学院北京协和医学院的金奇教授，首次对红色毛廯菌展开高通量定量蛋白质组学与乙酰化修饰组学研究。其研究不仅仅考察其蛋白质层面的差异，同时还对红色毛廯菌翻译后修饰展开。
依托景杰生物基于高分辨率质谱平台的蛋白质修饰组学技术，金奇教授团队从红色毛廯菌分生孢子的285个蛋白中鉴定到386个乙酰化修饰位点，在其菌丝的2335个蛋白中鉴定到5414个乙酰化修饰位点。两个生长阶段，其乙酰化修饰差异都与其自身蛋白合成联系紧密，不同之处在于红色毛廯菌两种不同生长阶段其KEGG通路和表观遗传调控差异极大。
研究者还指出，通过体外添加乙酰基转移酶抑制剂/组蛋白去乙酰化酶，能够显著抑制真菌的生长，进而引起细胞凋亡，或可成为根治真菌病的新方向。
在本文中，景杰生物作为合作伙伴，为科研工作者提供了高度的专业性、系统性、学术性的一站式组学服务。通过基于高分辨率质谱的定量蛋白质（修饰）组学，综合性分析筛选样本间差异蛋白，以靶向蛋白质组学（PRM）代替传统的WB对差异蛋白表达进行验证，同时提供多种高品质修饰抗体助力后续分子机制研究，形成了一整套完整的蛋白质组学策略范式，逐步构建起“一站式”、“从无到有”、“从浅到深” 三位一体的蛋白质组学服务第一平台。
研究思路
作者首先通过高通量蛋白质组学和乙酰化修饰组学的整合分析（如图1），发现红色毛廯菌不同生长阶段蛋白质水平和乙酰化修饰水平存在巨大差异，并利用靶向蛋白质组技术（PRM）对蛋白表达情况进行验证，同时作者还利用景杰生物提供的特异抗体对乙酰化修饰位点进行了一致性验证，结果与组学数据高度一致。接下来作者在细胞水平设计了功能实验，证实外源添加赖氨酸乙酰基转移酶（KATs）抑制剂或者组蛋白赖氨酸去乙酰酶（KDACs），可以显著影响真菌细胞的存活与凋亡，并通过荧光显微镜技术更直观的验证了这一现象。这为新型抗真菌药物的研制提供了直接的实验依据。
图1.研究思路流程示意图
研究成果
研究人员首先对红色毛廯菌分生孢子和菌丝两个生长阶段展开定性与定量蛋白质组学研究，在分生孢子和菌丝阶段分别鉴定到244和418个特异蛋白，同时鉴定3681共有蛋白。以差异倍数>2或<0.5为阈值，p值<0.05，定量到1879个差异蛋白（DEPs）。其中1612个蛋白上调，267个蛋白下调。接下来作者通过景杰生物的靶向蛋白质组学技术（PRM）对筛选的14个差异蛋白进行验证，结果（如表1）显示PRM验证结果与label-free定量结果高度一致。这也表明，靶向蛋白质组学技术可以很好的替代传统的WB进行蛋白质表达差异验证。更值得一提的是，PRM技术在合成多肽的前提下最多可以一次验证30个差异蛋白，这也正是PRM更有可能直接应用于临床的主要原因。
通过GO富集分析（如图2），发现分生孢子的特异蛋白主要涉及碳水化合物及氮循环代谢途径，而不同阶段显著下调的差异蛋白在氧化还原过程，蛋白水解过程与磷酸戊糖途径显著富集。尤其是磷酸戊糖途径的限速酶6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，表明分生孢子阶段红色毛廯菌磷酸戊糖途径代谢活力明显强于菌丝阶段。在功能分类分析中发现，致病性相关的分泌蛋白酶在孢子阶段富集，如黏附蛋白TERG_02242T0，在感染的早期对宿主的角质层进行纵向结合。
图2.全细胞蛋白质组GO分析
A.孢子阶段特异蛋白GO分析；B.菌丝阶段特异蛋白GO分析；C.不同阶段差异蛋白GO分析
而菌丝阶段的特异蛋白主要与辅因子生物合成及脂代谢途径有关，分子功能主要涉及核酸酶活性及其外切酶活性。此外，N-乙酰基转移酶活性与乙酰基转移酶活力显著增强，表明菌丝阶段菌体乙酰化修饰可能发挥着重要的生物学功能。于是作者对不同阶段的孢子与菌丝开展乙酰化修饰组学定性分析。
在定性实验中共鉴定到2422蛋白、5580个乙酰化修饰位点，其中孢子阶段285个蛋白鉴定到386个乙酰化位点，菌丝阶段2335个蛋白鉴定到5414个乙酰化修饰位点。发生乙酰化修饰的蛋白占红色毛廯菌总蛋白组的23.25%，远高于目前已经报道的其他真菌。鉴于红色毛廯菌从孢子发育成菌丝，涉及到复杂而精密的表观遗传调控，作者着重分析了鉴定到的42个组蛋白乙酰化修饰位点，其中有15个位于组蛋白H2B上，所有这些乙酰化修饰位点在其他物种中均高度保守（如图3）。组蛋白乙酰化修饰在调控基因转录、DNA复制、DNA修复和基因调节过程中发挥重要作用，这与真菌的生长及其致病性息息相关。
接下来，作者通过WB对两个组蛋白乙酰化修饰位点（菌丝特异的H4K78ac及共同的H4K17ac）进行验证，验证结果与质谱鉴定结果一致。同时作者整合先前报道的琥珀酰化数据发现，有4个组蛋白修饰位点同时发生乙酰化和琥珀酰化2，这表明酰化修饰的广泛性与交叉性，探索这两种修饰的生物学功能显得尤为重要。
A.在其他物种中鉴定到的组蛋白乙酰化修饰位点（字母B代表该位点在孢子与菌丝阶段均发生乙酰化修饰，字母M表示该乙酰化修饰只发生在菌丝阶段）；B.两个乙酰化修饰位点WB验证实验
在二级结构分析中（如图4），研究者发现乙酰化的赖氨酸多位于α-螺旋（45.1%）及线圈（44.6%），同时发生乙酰化修饰的赖氨酸位于蛋白表面的较少，这个现象刚好与其琥珀酰化修饰相反。这都表明每一个修饰都有独特的生物学功能，于是作者对乙酰化修饰组与琥珀酰化修饰组数据进行关联分析。
研究者对两组数据进行overlap，发现231个蛋白上257个位点同时发生乙酰化和琥珀酰化修饰。为了进一步分析这种修饰之间的关系，作者将这些蛋白分成4类，结果（如图5）显示1型和2型修饰蛋白共同调节更多的基础生物学过程。
图5.基于KEGG富集乙酰化修饰与琥珀酰化修饰相关性热图分析
那么，如此显著的乙酰化修饰差异具体有哪些生物学意义呢？
研究者通过添加赖氨酸乙酰基转移酶（KATs）抑制剂或者组蛋白赖氨酸去乙酰酶（KDACs）来考察乙酰化修饰水平差异对真菌存活及凋亡的影响。作者在本次研究中分别用了6种KATs抑制剂或者KDACs来干扰真菌细胞的乙酰化水平（如图6）。其中4种抑菌效果明显，且呈现出浓度依赖性。接下来作者通过TUNEL检测细胞凋亡过程中的DNA碎片，发现添加0.1%DMSO（control）没有明显的荧光，而添加抑制剂后荧光变化明显，表明抑制剂处理确实会引起细胞的凋亡。
图6.KATs和KDACs抑制剂对真菌生存能力的影响
小结
本文对红色毛廯菌展开高通量定量蛋白质组学与乙酰化修饰组学研究，不仅仅考察其蛋白质层面的差异，同时还对红色毛廯菌翻译后修饰展开研究。结果揭示了红色毛廯菌不同生长阶段蛋白质水平和乙酰化修饰水平的巨大差异。接下来，作者在细胞水平设计的功能实验，证实外源添加赖氨酸乙酰基转移酶（KATs）抑制剂或者组蛋白赖氨酸去乙酰酶（KDACs），可以显著影响真菌细胞的存活与凋亡，研究成果为新型抗真菌药物的研制提供了直接的实验依据，
文献：
1. Xingye Xu，et al., 2018, The first whole-cell proteome- and lysine-acetylome-based comparison between Trichophyton rubrum conidial and mycelial stages，Journal of proteome reseach. DOI: 10.1021/acs.jproteome.7b00793.
2. Qi Jin, et al., 2017, The first succinylome profile of Trichophyton rubrum reveals lysine succinylation on proteins involved in various key cellular processes. BMC Genomics, 18 (1), 577.
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