植物逆境研究——定量磷酸化组学揭示大豆类黄酮代谢途径参与盐胁迫响应

编者按

 植物生长发育过程中，随时面临着各种非生物逆境胁迫，如干旱、高盐、极端温度和创伤等，这些逆境胁迫对植物的生长发育产生了严重影响，在农业上造成农作物减产，导致极大的经济损失。因此，植物逆境生物学研究一直是植物学领域的热点与难点，研究植物逆境信号转导的分子机制，具有重要的理论意义和实际应用价值。

17年12月，小编给大家介绍过南京农业大学谢彦杰课题组在植物领域著名期刊Plant Cell & Environment上发表的科学发现，研究者通过蛋白组和修饰组学数据，首次报道了水稻可以通过改变自身乙酰化和琥珀酰化修饰来响应外界氧化胁迫刺激。

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今天小编为大家介绍，最近在著名蛋白组学期刊Molecular &Cellular Proteomics上发表的由我国科学家完成的题为Quantitative Phosphoproteomic and Meta-bonomic Analyses Reveal GmMYB173 Optimizes Flavonoid Metabolism in Soybean under Salt Stress 的论文。该研究对盐胁迫下大豆根组织磷酸化组、代谢组变化展开分析，发现了与耐盐相关的一些磷酸化蛋白（转录因子），报道了一个参与类黄酮代谢的耐盐途径，该途径能够被MYB转录因子磷酸化介导。该研究主要由杭州师范大学的杜立群教授、王慧中教授课题组的科学家完成。

伴随着蛋白质组学技术的快速发展，越来越多的科学研究选择运用蛋白质组学技术系统阐述植物非生物逆境胁迫中的分子机制。这一系列的研究发展与技术进步，会对将来的植物学领域的发展带来积极的促进效果。

景杰生物作为蛋白质组学与修饰组学的领跑者，一直致力于探索蛋白质组学在不同领域的使用，其提供的“植物逆境研究整体解决方案”，利用蛋白质组学技术及修饰化组学技术，系统研究各种植物外源胁迫信号对植物生长发育的影响和调控，从分子水平和蛋白层面揭示其内在规律，解析其代谢调控和信号转导网络，同时还提供相应的高灵敏度修饰类泛抗体助力您的研究。

关键词：大豆，盐胁迫，定量磷酸化组学，代谢组学，类黄酮，MYB转录因子、GmMYB173，查尔酮合成酶、GmCHS5

研究思路与结果

首先，研究者选取盐胁迫和非盐胁迫处理的大豆根组织开展定量磷酸化组学，以研究盐胁迫处理条件下的关键信号元件。通过质谱分析，对定量到的磷酸化肽段进行motif分析，发现上调组和下调组均有9个磷酸化motif显著富集，同时观察到当S(Ser,丝氨酸）位于磷酸化残基的中心时磷酸化肽段才具有保守性（图1A,图1B）。通过Motif分析结合相关数据库可确认它们是哪些激酶的底物，其中GmMYB173含有GmCK2（酪蛋白激酶2）能够识别的motif（sxD）

图1.A上调组磷酸化motif  B下调组磷酸motif  C GmMYB173是GmCK2α底物

对定量数据分析显示GmMYB173在盐胁迫中明显上升并在S59位点发生了磷酸化，因为只发现了一个磷酸化肽段，需要对组学数据进行进一步的确认，研究者通过体外激酶活性实验验证证明GmMYB173是GmCK2α底物。进一步研究显示GmMYB173作为MYB转录因子家族中的一员，定位在大豆根细胞的细胞核中（图2）。

图2.GmMYB173定位在细胞核

查尔酮合成酶CHS是类黄酮合成过程中的关键酶，类黄酮在植物体内种类很多，参与各个生物学过程。为分析盐胁迫条件下根组织代谢产物如类黄酮的情况，研究者利用代谢组学进行研究。组学数据显示，类黄酮物质分别有41个和66个负响应和正响应，正响应中的物质包括了花青素，这些结果表明不同种类的类黄酮对大豆耐盐表现具有重要影响。通过影响类黄酮的形成，CHS在耐盐胁迫调控网络中发挥着核心的作用，即盐胁迫能够激发CHS的表达。

CHS启动子区域含有MYB转录因子结合的顺式作用元件，GmCHS5是大豆CHS家族中的一员，为验证GmMYB173是否能够与GmCHS5互作，研究者首先利用转基因根系为材料做ChIP-qPCR，实验结果证明GmMYB173很可能结合在启动子CHS5-P3位点（图3A-C）。为确认两者互作，研究人员利用对普通根系为材料开展EMSA实验，结果表明GmMYB173蛋白能够与CHS5-P3探针结合，并对其序列具有依赖性。因为GmMYB173磷酸化位点S59与DNA结合区域（aa 74-130）相近，所以利用位点S59构建模拟持续磷酸化状态的突变体S59D和磷酸化功能缺失的突变体S59A，EMSA实验结果表明GmMYB173 S59位点磷酸化能够促进它与GmCHS5启动子区域结合。

图3 A-C,ChIP-qPCR表明GmMYB173很可能结合在启动子CHS5-P3位点

D,EMSA实验表明GmMYB173蛋白能够与CHS5-P3探针结合，并对其序列具有依赖性

E, ,EMSA实验表明GmMYB173 S59的磷酸化促进它与GmCHS5的结合

为研究内源GmMYB173是否影响GmCHS5转录水平，构建GmMYB173的超表达和RNAi根系进行RT-qPCR研究，结果表明GmMYB173正向调控GmCHS5（图4F-G）。在盐处理前后GmMYB173转录水平没有明显变化（图4H），而盐胁迫却能够激发GmCHS5的表达，结合质谱数据GmMYB173在盐处理后S59的磷酸化显著增加，表明是盐胁迫中GmMYB173磷酸化水平的增加促进了它与GmCHS5的结合而促进了GmCHS5的表达。

图4  F-G,GmMYB173-OE 和GmMYB173-KD根系中GmCHS5表达

H,盐胁迫前后GmMYB173转录水平没有明显变化

为研究内源的GmCHS5和GmMYB173及其磷酸化如何通过调控类黄酮代谢来增强耐盐能力，研究人员接着分析了内源类黄酮变化，以GmMYB173和GmCHS5的超表达及RNAi, GmMYB173_S59D，GmMYB173_S59A根系，等为材料研究花青素（盐胁迫正响应类黄酮）的变化。HPLC结果显示盐胁迫下GmCHS5超表达根系中花青素的表达显著增加，GmMYB173_S59D花青素含量明显比GmMYB173_S59A（几乎检测不到）高，说明GmMYB173的S59磷酸化对于GmMYB173和类黄酮代谢的激活是必需的。

植物抗氧化的能力与耐盐呈正相关，所以研究人员测试了上述所有转基因根系的ROS清除活性，实验结果表明，所有的转基因根系在盐胁迫下都有抗氧化反应，GmCHS5和GmMYB173正调控ROS清除活性。GmMYB173_S59D，ROS清除活性最强，GmMYB173-KD最弱，表明GmMYB173磷酸化能够正调控ROS清除活性。

最后研究人员比较了所有转基因根系的耐盐能力，显示GmMYB173_S59D耐盐能力强于GmMYB173和GmMYB173_S59A根系（图5）。

 图5，根系耐盐能力对比

总结

植物对于胁迫的反应往往伴随着一系列的物质能量代谢变化，本文利用磷酸化组学和代谢组学，将激酶-磷酸化，MYB转录因子和盐胁迫响应因子，酶和代谢的调控网络整合起来，最终阐释GmMYB173磷酸化修饰调控类黄酮合成的关键基因GmCHS5，参与类黄酮合成而参与耐盐胁迫。这类多维组学整合的思路，为植物胁迫研究乃至其他类似方向的研究提供很好的研究思路。

参考文献：

1. Heng Zhou, et al. Oxidative stress-triggered interactions between the succinyl- and acetyl-proteomes of rice leaves.Plant Cell & Environment. 2017

2. Erxu Pi, et al. Quantitative Phosphoproteomic and metabonomic analyses reveal gmMYB173 optimizes flavonoid metabolism in soybean under salt stress. Molecular Cellular Proteomics.2018

景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。