MCP：蛋白组学筛选牙周病的生物标志物
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景杰编者按：
蛋白质组学（Proteomics）本质上是指在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学对生命科学研究，乃至未来的精准医学都具有重要意义，是生命科学进入后基因时代的特征。
定量蛋白质组学技术不仅应用于多种基础研究，而且已经面向临床医学，围绕疾病的预防、早期诊断、治疗等方面开展研究。本文以定量蛋白质组学技术，筛选唾液样本内牙周病标志物，为免疫治疗、药物开发和精准医疗提供强力支撑，是临床疾病标志物（Biomarker）筛选的一般性思路，可作为疾病诊断、治疗、预后等标志物研究的范例。
研究背景
牙周病是指发生于牙齿周围组织的疾病，是常见的口腔疾病。本病在早期多无自觉症状，且缺乏有效的分子诊断手段，因此该病的早期诊断仍然具有挑战性。唾液是一种无创性临床样本，包含有价值的临床相关生物标记物，如果有效利用可以促进早期疾病的诊断和监测。
来自瑞典卡罗琳学院口腔医学部的研究人员利用定量蛋白组学对67例（包括健康、慢性牙周炎、牙龈炎、侵袭性牙周炎）临床唾液样本进行定量分析，发现119个显著差异表达的蛋白（fold change>2）。研究者挑选65个靶蛋白（包括50个功能相关的差异蛋白、11个文献报道的蛋白、4个管家基因），在82个队列样本中进一步验证，最终得到12个蛋白对牙周疾病具有很好的鉴别能力。该研究结果发表在国际著名期刊Molecular & Cellular Proteomics上。
关键词：牙周病、定量蛋白质组学、诊断标志物、label-free、靶向蛋白质组学
研究思路
本文研究内容主要包含两部分：① 基于Label-free定量蛋白组学筛选牙周病诊断标志物。② 基于靶向蛋白质组学对挑选的候选标志物进行广泛验证。
研究结果
1. 定量蛋白组学筛选候选标志物：
研究者共采集了67例临床唾液样本，包括17例慢性牙周炎(CP)患者唾液，17例侵袭性牙周炎(AP)患者唾液，17例牙龈炎(G)患者唾液以及16例健康人(H)唾液。所有唾液样本均采集于8:00-10:00 (该时间段内唾液样本变化最小)。通过label-free定量蛋白组学分析共鉴定到486个蛋白（图2）。其中7个共同差异表达的蛋白为calmodulin-like protein 5 (CALML5), cystatin-B (CSTB), extracellular matrix protein 1 (ECM1), carboxylesterase 2 (EST2), Ig heavy chain V-III region, antileukoproteinase (SLPI) 和cornifin-B (SPRR1B)，且均为下调蛋白（疾病组Vs健康组）。
非标(Label-free)蛋白质组定量技术是一种不依赖于同位素标记的新型蛋白质定量技术，该技术通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行分析，无需昂贵的稳定同位素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样本中相应肽段的信号强度，就能对相应的蛋白质进行相对定量。
label-free定量蛋白组学具有无需昂贵的同位素标记试剂，实验耗费低；对样本的操作最少，使其最接近原始状态；不受样本条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷的优势，因此广泛运用于疾病标志物筛选、药物作用靶点研究、特殊功能蛋白质筛选、植物抗逆研究等研究领域。
2. 靶向验证候选标志物
研究者利用GeneGo´s MetaCore Pathway分析工具对LFQ数据进行Pathway、GO process、Process Network等富集分析，挑选富集程度排名前十的通路蛋白作为候选标志物（共50个蛋白）。另外研究者还根据文献报道和LFQ数据挑选了11个候选蛋白，同时为了对不同样本进行归一化处理，还额外挑选了4个管家基因(分别为Alpha-2-macroglobulin (A2M), Enolase (ENOA), Hemopexin (HEMO), Fibrinogen beta chain (FIBB))。
研究者重新搜集了82例临床样本，其AP (n=21)，CP (n=21)，G (n=20)，H (n=20)，利用SRM技术对上述筛选的65个蛋白进行了后续的靶向验证。最终成功在75例唾液样本中定量到60个蛋白，定量成功率达92%。在定量到的60个蛋白中，有22个蛋白在疾病组（G，CP，AP）Vs健康组（H）表现出显著差异（fold change>2, P<0.05），其中在疾病组只有2个蛋白显著上调，其余20个蛋白均显著下调（图3）。
图3 疾病组VS健康组差异表达蛋白火山图
随后研究者对差异蛋白进行ROC曲线及曲线下面积(AUC)统计分析，发现其中有12个蛋白具有较高的AUC (AUC 0.83-0.91)，表明这12个蛋白对牙周疾病具有很好的指示作用（图4）。
尽管单个蛋白已经对牙周病具有很好的鉴别指示，但研究者还进一步评估了如果整合3个蛋白是否能提高其特异性与灵敏性。研究者将所有可能的蛋白以3为一组，得到34220个逻辑回归模型，挑选AUC排名前10%模型，分析计算某个蛋白被使用频率和协同系数（图5）。上调蛋白（疾病VS健康）中协同系数排名前三蛋白是MMP9、RAP1A、ARPC5，下调蛋白（疾病VS健康）协同系数排名前两位的蛋白分别是CLUS和DBMT1。具有最高预测能力的蛋白对是ARPC5和CLUS。
小结
研究者通过Label-free定量蛋白组学技术广泛筛选牙周疾病病人唾液中差异表达的蛋白，并通过生信分析结合之前的文献报道，筛选了65个蛋白作为牙周疾病的候选蛋白标志物。然后研究者利用靶向蛋白质组学技术对这65个候选标志物进行扩大样本验证，最终得到12个蛋白对牙周疾病具有很好的鉴别能力。运用逻辑回归模型对蛋白组合进行筛选，最终发现具有最高预测能力的蛋白对是ARPC5和CLUS。本文思路是临床疾病标志物筛选的一般性思路，可作为疾病诊断、治疗、预后等标志物研究的范例。
参考文献
Nagihan Bostanci, et al. (2018), Targeted proteomics guided by label-free global proteome analysis in saliva reveal transition signatures from health to periodontal disease. Molecular & Cellular Proteomics.
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