磷酸化蛋白质组学揭示黑色素瘤治疗新靶标
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景杰编者按：
黑色素瘤（Melanoma）多由黑色素细胞所形成的痣或黑色素斑发生恶变而来，是最常见的皮肤三大恶性肿瘤之一，也是皮肤肿瘤中恶性程度最高的瘤种，容易出现远处转移，因此早期诊断和治疗因而显得尤为重要。
以黑素细胞丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）为靶点的BRAF与MKK抑制剂联合疗法，是临床治疗BRAF V600突变转移性黑色素瘤的有效方法。然而肿瘤治疗中的药物抗性问题依旧是获得更好临床效果的一个障碍，开发新的抑制剂，采用多种药物联用的疗法有望成为临床治疗的有效策略。
近期一篇报道在Molecular & Cellular Proteomics上的文章，通过蛋白质组学手段，分析了黑色素瘤细胞分别在MKK1/2和ERK1/2两种抑制剂刺激下的磷酸化信号通路的差异变化，最终发现两种抑制剂调节的磷酸化反应具有比较高水平的重叠性，并找到82个潜在的新型的ERK作用靶标。
值得一提的是，研究针对的BRAF V600突变在欧美欧美黑色素瘤患者中发生率较高，约有一半以上具有，中国患者有突变的比例相对低一些为20-25%。此外，与欧美主要分布在皮肤浅表的皮肤型不同，中国有约50%患者的黑色素瘤是分布在四肢末端皮肤的肢端型，更容易发生转移。因此中国的黑色素瘤治疗需要更深层次地探索。
景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。
研究背景
有研究发现，在细胞模型和异种移植瘤中对BRAF或MKK1/2抑制剂有抗性的肿瘤细胞，对ERK1/2抑制剂却是敏感的。因此开发ERK1/2抑制剂有望成为抵抗BRAF与MKK药物抗性的有效策略，而且目前已有一些ERK1/2抑制剂已进入了早期临床试验阶段。那么一个悬而未决的问题是： ERK1/2抑制剂和MKK1/2抑制剂是否作用于不同的分子靶标。
研究者以WM239A转移性黑色素瘤细胞为研究对象，通过蛋白质组学手段，分析了其分别在MKK1/2和ERK1/2抑制剂刺激下的磷酸化信号通路的差异变化。生物信息学分析后发现：MKK1/2与ERK1/2 抑制剂调节的磷酸化反应具有比较高水平的重叠性，仅受一种抑制剂调节的磷酸化反应较少；21个磷酸化位点特异性仅受一种抑制剂的影响；最终找到82个潜在的新型的ERK作用靶标。
关键词：黑色素瘤细胞，磷酸化蛋白质组学，ERK1/2抑制剂，，MKK-MAP 激酶
研究思路和成果
首先，研究者运用SILAC定量蛋白质组学技术，对两种抑制剂刺激下的磷酸化信号通路的差异变化进行分析。为了达到理想的效果，研究者采用SILAC同位素标记（重标、中标、轻标），分别用MKK1/2抑制剂（Trametinib曲美替尼）和ERK1/2抑制剂(SCH772984)刺激WM239A转移性黑色素瘤细胞，DMSO carrier为对照，三种处理-三种标记SILAC-三次生物学重复（每个抑制剂的处理的三次重复采用不同的SILAC标记）。结果共鉴定到12805个可定量的磷酸化位点，对应3819个蛋白质，其中8390个位点可在两到三次重复中被定量，有398个磷酸化位点显著变化1.8倍以上。
SILAC定量蛋白质组学，即细胞培养条件下稳定同位素标记技术，基本原理是分别用天然同位素（轻型）或稳定同位素（重型）标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经>6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中取代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定。
技术优势与运用
多个样本混合后同时进行分离、酶切和鉴定，后续实验对样品的影响是一致的，减少了实验操作和仪器设备引入的定量误差；体内标记技术，标记不受裂解液成分影响，效果稳定，标记效率高达99%；灵敏度高，样本量要求少。
广泛运用于疾病标志物筛选作用机制研究、药物作用靶点研究、特殊功能蛋白质筛选等领域。
接下来，研究者通过Western Blot验证p38α MAPK、ERK蛋白及其磷酸化水平。结果发现Trametinib 能显著抑制p38α MAPK的 Thr180和Thr182的磷酸化(而SCH772984、Selumetinib、Vemurafenib处理后无变化)，且由Trametinib引起的p38α MAPK磷酸化水平的降低可受到高渗透压的逆转作用，因此证明：Trametinib可特异性的阻断p38α MAPK的磷酸化（图2）。
研究者同时检测了受Trametinib 抑制的MKK6、MKK6 EE（active）、MKK6 KA（inactive）的激酶活性，发现通过p38α MAPK，MKK6 EE展现出比MKK6更高的活性（图3），证明：Trametinib通过抑制MKK6，从而导致p38α MAPK磷酸化水平的下降。
随后，研究者为了比较同属ERK1/2抑制剂的SCH772984与GDC0994处理的磷酸化反应的差异情况，继续进行了3组三次重复的磷酸化蛋白组学实验（图4）。一共鉴定到7074个磷酸化位点，对应2876个蛋白，其中有5328个磷酸化位点在至少两次重复中可被定量到，有325个磷酸化位点在至少一个ERK1/2抑制剂处理下（SCH/GDC）有显著差异，在这325个磷酸化位点中，有288个磷酸化位点（88%）同时在SCH或GDC处理下显著上调，6个磷酸化位点特异性地仅在SCH772984处理下显著下调。
图4. ERK1/2抑制剂和MKK1/2抑制剂的磷化组学比较
ERK1/2抑制剂：SCH772984 VS GDC0994
MKK1/2抑制剂：Trametinib vs Selumetinib
研究者同样分析了同属MKK1/2抑制剂的 SEL与TRA的磷酸化蛋白组学数据，发现249个蛋白都受到SEL与TRA的抑制作用，10个蛋白仅受到TRA的抑制，2个蛋白仅受到SEL的抑制。
最后研究者综合分析了4种抑制剂，包括2个MKK1/2 抑制剂(trametinib和selumetinib)、2个ERK1/2 抑制剂 (SCH772984,GDC0994)的磷酸化蛋白质组学数据，进一步分析特定抑制剂所特异调控的途径（图5）。发现：MKK1/2与ERK1/2 抑制剂调节的磷酸化反应具有比较高水平的重叠性，仅受一种抑制剂调节的磷酸化反应较少；21个磷酸化位点特异性仅受一种抑制剂的影响；最终找到82个潜在的新型的ERK作用靶标；
小结
本研究通过蛋白质组学手段，分析了WM239A转移性黑色素瘤细胞分别在MKK1/2 抑制剂、ERK1/2 抑制剂刺激下其磷酸化信号通路的差异变化。生物信息学分析后发现：MKK1/2与ERK1/2 抑制剂调节的磷酸化反应具有比较高水平的重叠性；21个磷酸化位点特异性仅受一种抑制剂的影响；最终找到82个潜在的新型的ERK作用靶标。研究结果为黑色素瘤临床治疗和精准药物研发指明了方向。
Basken J, et al. (2017) Specificity of phosphorylation responses to MAP kinase pathway inhibitors in melanoma cells. Molecular & Cellular Proteomics.
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